油橄欖葉提取物體內外抗氧化活性研究

鄭 潔 ，何海榮，王寧麗，裴 棟，田亞濤，謝雪健，劉曄瑋*

蘭州大學公共衛生學院營養與食品衛生研究;2 中國科學院蘭州化學物理研究所 中科院西北特色植物資源化學重點實驗室，蘭州 730000

油橄欖(Olea europaeaL.)屬木樨科(Europaea)木樨欖屬(Olea)植物，是世界著名的常綠木本油料和果用樹種［1］。流行病學［2，3］和動物實驗［4］都證明了橄欖油具有降低心血管疾病、胃癌、乳腺癌等疾病發病率的潛在作用，這種作用不僅歸因于橄欖油中不飽和脂肪酸和維生素等生物活性物質，還與其中具有抗氧化活性的酚類化合物有關［5］，而油橄欖葉中的抗氧化活性物質含量高于油橄欖果、莖和樹皮［6］。

目前，關于油橄欖葉提取物的分離純化［7，8］及抗癌［9，10］、降血壓［11］、降血糖［12］等各種生理活性及體外抗氧化活性的研究較多，Coban［13］等研究了油橄欖葉提取物的體內抗氧化活性，但對其抗氧化活性的系統研究鮮見報道。本文通過觀察小鼠體內抗氧化指標和組織形態學的變化，結合體外清除DPPH·和·OH 的能力，系統研究了油橄欖葉提取物的抗氧化作用，為充分利用目前被廢棄的油橄欖葉，開發具有保健功能的油橄欖多酚產品，延長產業鏈，實現種植和精深加工多形式的優化組合提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試樣品

油橄欖葉提取物(隴南田園油橄欖科技開發有限公司提供，課題組經HPLC 法測定橄欖苦苷含量為22.3%);橄欖苦苷(購自青島耐特生物技術有限公司，課題組經HPLC 法測定其含量為98.2%)。

1.1.2 主要試劑與儀器

試劑:D-半乳糖(D-gal)、Coomassie Brilliant Blue G-250、Albumin Bovine V(Sigma，美國);維生素E(VE)(江西天之海藥業股份有限公司);1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH·)標準品(批號S43654-098，Sigma，美國);抗壞血酸對照品(批號:A-4544，購自Fluka 公司，美國);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號:20140312，南京建成生物工程研究所);其它試劑均為分析純，水為實驗室自制雙蒸水。

儀器:旋渦混合器(海門市麒麟醫用儀器廠);L600 臺式低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司);Microfuge?22R Centrifuge(美國貝克曼庫爾特/Beckman Coulter);UV759 紫外-可見分光光度計(上海精密儀器科技有限責任公司)。

1.1.3 實驗動物

25 g 左右雄性健康成年昆明種小鼠90 只，購于蘭州大學醫學院動物實驗中心(動物合格證號:甘醫動字第14-006);飼養條件:溫度18～22 ℃，光暗周期12 h:12 h，群養，3 只/籠，常規喂養飼料，自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 體外清除自由基作用

參照文獻［14，15］方法及預實驗結果，以抗壞血酸、橄欖苦苷為對照，測定各質量濃度的油橄欖葉提取物對DPPH·和·OH 的清除率，分別計算其半數抑制濃度(IC50)。

1.2.2 D-gal 致衰老小鼠抗氧化作用

1.2.2.1 動物分組及給藥劑量設置［16］

小鼠按體重隨機分為6 組，即:空白組、D-gal 模型組、油橄欖葉提取物低、中、高劑量組、VE 組。油橄欖葉提取物組給藥量分別為58、116、232 mg/kg BW;VE 組VE 灌胃100 mg/kg BW;空白組與D-gal模型組灌胃等量生理鹽水。除空白組外，其余各組均每日頸背部皮下注射D-gal 200 mg/kg BW，注射量為0.1 mL/10 g，空白組每日皮下注射等量生理鹽水。每3 d 稱體重和食物，換算灌胃量并計算食物利用率。D-gal 與油橄欖多酚均連續給藥30 d。

1.2.2.2 體內抗氧化指標測定

各組于實驗末日禁食16 h 后摘眼球采血，離心取血清-80 ℃保存備用，同時迅速取出小鼠腦、肝組織做成10%勻漿，離心取上清液-80 ℃保存備用。按試劑盒說明操作，測定血清、肝組織、腦組織中MDA 含量、SOD 和GSH-Px 活性;蛋白質測定采用考馬斯亮藍法。

1.2.2.3 小鼠肝臟和大腦組織形態學觀察

取部分肝臟和大腦組織，制成HE 染色切，在光學顯微鏡下觀察。

1.2.3 數據處理

實驗結果采用SPSS17.0 軟件進行單因素方差分析、多重比較和直線回歸分析。以P＜0.05 為結果差異存在統計學意義，以P＜0.01 為更有理由相信結果差異存在統計學意義。

2 實驗結果

2.1 體外清除自由基作用

各質量濃度的油橄欖葉提取物對DPPH·和·OH均有一定的清除作用，并呈劑量-效應關系(圖1、2)。抗壞血酸、橄欖苦苷和油橄欖葉提取物對DPPH·和·OH 的IC50分別為0.016、0.058、0.064 mg/mL;0.052、0.046、0.066 mg/mL。

圖1 油橄欖葉提取物清除DPPH·的活性Fig.1 DPPH· scavenging activities of O.europare leaf extracts

圖2 油橄欖葉提取物清除·OH 的活性Fig.2 ·OH scavenging activities of O.europare leaf extracts

2.2 小鼠血清、肝臟組織、大腦組織的MDA 含量、SOD 和GSH-Px 酶活性測定結果

各組血清、肝臟組織的SOD、GSH-Px 活性和大腦組織的SOD 活性與D-gal 模型組比較都有所增加(表1～3)，差異均有統計學意義;各組血清、肝臟組織以及高劑量組大腦組織的MDA 水平的與D-gal模型組比較都有所降低(表1～3)，差異均有統計學意義。說明衰老模型建立成功。與空白組相比，各組高劑量組的GSH-Px 活性明顯升高(表1、2)，SOD活性明顯升高(表1～3)，MDA 含量明顯降低(表1～3)，差異具有統計學意義。表明油橄欖葉提取物能顯著提高體內抗氧化酶活力。

2.3 小鼠肝臟和大腦組織形態學觀察

2.3.1 肝臟組織形態學觀察

D-gal 模型組肝小葉失去正常結構，肝索排列紊亂，肝細胞彌漫水腫，界限不清，胞漿疏松化或呈空泡樣變，細胞形態不規則，排列不整齊，可見點狀壞死，肝血竇變狹窄，血管外周間隙增大(圖3B)。油橄欖葉提取物低、中、高劑量組肝小葉結構、肝細胞索排列、肝細胞水腫、細胞增生程度與D-gal 模型組相比，逐步恢復，并隨油橄欖葉提取物劑量的增加，恢復程度也逐漸增加(圖3 C、D、E);VE 組肝小葉結構基本恢復正常，肝細胞索排列規則，細胞輕度增生(圖3F)。

表1 油橄欖葉提取物對血清MDA、SOD、GSH-Px 的影響(±s，n=15)Table 1 Effect of O.europaea leaf extracts on serum MDA，SOD，GSH-Px levels (±s，n=15)

表1 油橄欖葉提取物對血清MDA、SOD、GSH-Px 的影響(±s，n=15)Table 1 Effect of O.europaea leaf extracts on serum MDA，SOD，GSH-Px levels (±s，n=15)

注:與D-gal 模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與空白組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。Note:Compared with the D-gal model group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;compared with the control group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01.

表2 油橄欖葉提取物對肝組織MDA、SOD、GSH-Px 的影響(±s，n=15)Table 2 Effect of O.europaea leaf extracts on liver tissue MDA，SOD，GSH-Px levels(±s，n=15)

表2 油橄欖葉提取物對肝組織MDA、SOD、GSH-Px 的影響(±s，n=15)Table 2 Effect of O.europaea leaf extracts on liver tissue MDA，SOD，GSH-Px levels(±s，n=15)

注:與D-gal 模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與空白組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。Note:Compared with the D-gal model group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;compared with the control group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01.

表3 油橄欖葉提取物對腦組織的MDA、SOD 的影響(±s，n=15)Table 3 Effect of O.europaea leaf extracts on brain tissue MDA and SOD levels(±s，n=15)

表3 油橄欖葉提取物對腦組織的MDA、SOD 的影響(±s，n=15)Table 3 Effect of O.europaea leaf extracts on brain tissue MDA and SOD levels(±s，n=15)

注:與D-gal 模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與空白組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。Note:Compared with the D-gal model group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;compared with the control group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01.

圖3 空白組(A)、D-gal 模型組(B)、低劑量組(C)、中劑量組(D)、高劑量組(E)及VE 組(F)肝臟組織HE染色照片(10 ×40)Fig.3 HE staining images of liver tissues from blank (A)，D-gal model (B)，low-dose (C)，middle-dose (D)，high-dose (E)and VE groups (10 ×40)

2.3.2 大腦組織形態學觀察

2.3.2.1 小鼠大腦皮層形態學觀察

D-gal 模型組神經元細胞排列稀疏紊亂，椎體細胞數量少，細胞脫失明顯，甚至僅見少量殘存的不規則細胞，并出現細胞核溶解，細胞輪廓不清晰，胞漿疏松，并有炎性細胞浸潤(圖4B)。油橄欖葉提取物低、中、高劑量組神經元細胞數量較多，細胞核多是中間位，可見少量細胞固縮，并隨著油橄欖葉提取物劑量的增大，恢復程度逐漸增加(圖4 C，D，E)。VE組神經元細胞基本恢復，數量較多，形態基本正常，細胞核多是中間位，可見少量細胞固縮(圖4 F)。

2.3.2.2 小鼠大腦海馬結構形態學觀察

圖4 空白組(A)、D-gal 模型組(B)、低劑量組(C)、中劑量組(D)、高劑量組(E)及VE 組(F)大腦皮層HE染色照片(10 ×40)Fig.4 HE staining images of cerebral cortex from blank(A)，D-gal model (B)，low-dose (C)，middle-dose(D)，high-dose (E)and VE groups (10 ×40)

D-gal 模型組小鼠海馬錐體細胞排列稀疏紊亂，細胞脫失明顯，甚至僅見少量殘存的不規則細胞，較多神經元出現核固縮、溶解，細胞間隙擴大，排列松散，細胞輪廓不清晰，胞質染色呈深紅色(圖5B)。油橄欖葉提取物低、中、高劑量小鼠海馬齒狀回區細胞結構相對完整，細胞形態良好，無明顯變性細胞，并隨著油橄欖葉提取物劑量的增大，恢復程度逐漸增加(圖5 C、D、E)。VE 組小鼠大腦海馬齒狀回區基本恢復，錐體細胞排列整齊、緊密，層次豐富，形態正常，無變性，核大而圓，細胞質豐富(圖5F)。

圖5 空白組(A)、D-gal 模型組(B)、低劑量組(C)、中劑量組(D)、高劑量組(E)及VE 組(F)海馬結構HE染色照片(10 ×40)Fig.5 HE staining images of hippocampal structure from blank (A)，D-gal model (B)，low-dose (C)，middle-dose (D)，high-dose (E)and VE groups (10 ×40)

3 討論

3.1 油橄欖葉提取物的抗氧化作用

體外實驗結果表明，油橄欖葉提取物能有效地清除DPPH·和·OH。體內實驗結果表明，油橄欖葉提取物能降低小鼠血清、肝臟和腦組織中的MDA含量，增加小鼠血清和肝臟組織中SOD 和GSH-Px的活性，增加小鼠腦組織中SOD 的活性，且呈劑量-效應關系，提示油橄欖葉提取物可能通過提高機體抗氧化酶的活性達到清除自由基的目的，從而增強了機體的抗氧化能力。體內、體外及病理形態學的結果都說明油橄欖葉提取物具有較好的抗氧化活性。

3.2 油橄欖葉提取物各成分間的抗氧化協同作用

油橄欖葉提取物除含有22.3%的橄欖苦苷，還有木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷和羥基酪醇醋酸酯［17］等多種抗氧化活性成分。Benavente［18］等研究報道，油橄欖葉提取物的Trolox當量抗氧化能力(TEAC)值比理論上提取物中其他酚類活性物質相加的平均TEAC 值高出72%，表明油橄欖多酚清除自由基能力具有協同作用;Mylonaki［19］等對油橄欖葉提取物的總多酚和其抗自由基活性值之間做了簡單線性回歸分析，結果顯示了低的相關性，無統計學差異(R2=0.273，P＞0.05)，這表明它不是純粹的多酚類物質提供高抗氧化能力，相反，這種效力可能是通過各種酚類成分之間的相互作用。因此，提示油橄欖葉提取物的抗氧化能力可能呈協同作用，即油橄欖葉提取物中的多種抗氧化活性成分共同協作，在機體內發揮較強的抗氧化功能。根據以上研究結果，本實驗中油橄欖葉提取物對衰老小鼠的抗氧化作用通過多種抗氧化成分共同作用，因而抗氧化能力較強。建議在今后對油橄欖葉的進一步加工和應用時，保留油橄欖葉提取物多種活性成分。

綜上所述，油橄欖葉提取物具有較好的抗氧化功能，其機制與清除體內自由基，增加體內抗氧化酶活性有關。本實驗對油橄欖葉提取物抗氧化功能的研究，為深入研究其抗氧化機制提供理論基礎，為天然藥物和保健食品的研究和開發提供理論和臨床依據。

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