馬鈴薯內(nèi)生拮抗真菌E-19 的分離、鑒定及其次生代謝產(chǎn)物研究

楊曼思，王文祥，李龍根，艾洪蓮，郭華春

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201

2015年1月6 日，農(nóng)業(yè)部副部長(zhǎng)余欣榮在“馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略研討會(huì)”上表示，今后要推進(jìn)馬鈴薯主糧化，力爭(zhēng)通過(guò)幾年的不懈努力，使馬鈴薯的種植面積、單產(chǎn)水平、總產(chǎn)量和主糧化產(chǎn)品在馬鈴薯總消費(fèi)量中的比重均有顯著提升，讓馬鈴薯逐漸成為水稻、小麥、玉米之后的我國(guó)第四大主糧作物。隨著馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的推出，馬鈴薯種植過(guò)程中所面臨的各種病害成為制約馬鈴薯單產(chǎn)水平和總產(chǎn)量的主要障礙之一。目前，馬鈴薯最嚴(yán)重的病害為馬鈴薯晚疫病(Phytophthora infestans)，廣泛分布于馬鈴薯各產(chǎn)區(qū)，其危害性、防治難度及對(duì)社會(huì)造成的巨大影響，已超過(guò)稻瘟病和小麥銹病，被視為全球第一大作物病害。在全國(guó)范圍內(nèi)，特別是降水充沛的西南山區(qū)和北方部分潮濕產(chǎn)區(qū)，晚疫病幾乎每年都有發(fā)生，由此造成馬鈴薯產(chǎn)量損失高達(dá)20%～80%。

植物內(nèi)生菌由于其物種豐富，數(shù)量龐大，而且與其它生物之間具有緊密的生態(tài)關(guān)系，使其成為天然活性物質(zhì)的豐富來(lái)源。Schulz 等報(bào)道［1］，從內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中獲得了135 個(gè)化合物，其中新化合物占51%，而土壤微生物產(chǎn)生的新化合物只占38%。從植物內(nèi)生菌中尋找新型先導(dǎo)化合物，創(chuàng)制高效、環(huán)保的新型農(nóng)藥，已經(jīng)成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。本文報(bào)道了從馬鈴薯健康植株分離、純化內(nèi)生真菌，并通過(guò)形態(tài)學(xué)和18S rDNA 序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以及對(duì)該菌次生代謝產(chǎn)物的分離、純化、鑒定結(jié)果，為開(kāi)發(fā)無(wú)污染、低殘留并且可以使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)種植進(jìn)入可持續(xù)的良性發(fā)展的微生物源農(nóng)藥奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

2014年3～4月份分別在大理、德宏、臨滄三地采集的馬鈴薯健康植株，用于內(nèi)生真菌的分離，均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)薯類研究所提供。

1.1.2 試劑

青霉素鏈霉素混合抗生素、75%無(wú)水乙醇、2%次氯酸鈉、葡萄糖、豬肉蛋白胨、瓊脂、酵母粉、KH2PO4、MgSO4(西隴化工股份有限公司)、柱層析用硅膠80～100 目、200～300 目和預(yù)制GF254TLC 板(青島海洋化工)，Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences 公司)，Chromatorex C-18(日本Fuji Silysia 化學(xué)公司)。

1.2 儀器

普通藥物天平(上海醫(yī)療器械廠)，立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，Bruker AVANCE Ⅲ-600、DRX-500 或AV-400 核磁共振儀，分析型HPLC(Agilent 1100 系列液相色譜儀)，半制備HPLC(Agilent Technologies 1200 系列液相色譜儀)，Horbia SEPA-300 旋光儀，UV-210A 型分光光度計(jì)，Bruker Tensor27 型紅外光譜儀，Waters AutoSpec Premier P776 質(zhì)譜儀。

1.3 內(nèi)生真菌的分離、純化

將采集的健康馬鈴薯植株的根、莖、葉在自來(lái)水下沖洗干凈，擦干，根莖剪成3 cm 的小段，葉剪成3 cm×3 cm 的小片，按下列程序進(jìn)行表面消毒:無(wú)菌條件下，75%乙醇漂洗1 min，無(wú)菌水沖洗3 次;2%次氯酸鈉消毒(消毒時(shí)間:根3 min;莖2.5 min;葉2 min)、無(wú)菌水沖洗3 次;然后置于無(wú)菌濾紙上將水分吸干。將表面消毒后的根、莖剪去兩端切口，剩余段從中間剖開(kāi)，剪成(0.3～0.5)cm3的小塊，葉剪去四周后將剩余部分剪成0.3 cm×0.3 cm 小塊。

消毒有效性評(píng)價(jià)采取3 種方法:一是取少量第3 次無(wú)菌水沖洗液涂抹新的培養(yǎng)基平板;二是用組織印跡法，將消毒好待處理的材料在未使用的培養(yǎng)基平板上輕輕滾動(dòng)或緊貼培養(yǎng)基放置5 min 后移走;三是在分離操作的同時(shí)將未使用的培養(yǎng)基平板打開(kāi)并暴露在無(wú)菌操作臺(tái)上。將上述3 種處理的培養(yǎng)皿置于22～25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

采用頂端菌絲純化法，每日定期觀察內(nèi)生真菌長(zhǎng)出情況，將切口處新長(zhǎng)出的菌絲挑取尖端部分轉(zhuǎn)接至PDA 培養(yǎng)基上，純化培養(yǎng)直至獲得純菌株，放置于4 ℃冰箱保存。

1.4 拮抗菌株的篩選

采用平板對(duì)峙拮抗實(shí)驗(yàn)法測(cè)定上述分離得到的內(nèi)生真菌的抑菌作用［2，3］。具體操作如下:在9 cm的PDA 平板上，分別接種待測(cè)菌株和靶標(biāo)病原菌，并使其間距為5 cm，置于22～25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察并記錄菌株生長(zhǎng)情況和菌株間的拮抗現(xiàn)象。

1.5 拮抗菌株的發(fā)酵

培養(yǎng)基:葡萄糖5%，豬肉蛋白胨0.15%，酵母粉0.5%，KH2PO4和MgSO4各0.05%;培養(yǎng)條件:溫度24 ℃;搖床轉(zhuǎn)速150 rpm;暗培養(yǎng)25 d。

1.6 拮抗菌株的鑒定

將內(nèi)生真菌接種于培養(yǎng)皿中，在靠近培養(yǎng)皿邊緣1/3 處45°斜插一個(gè)經(jīng)過(guò)滅菌的蓋玻片，置于22～25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，待菌絲長(zhǎng)至蓋玻片上時(shí)，取出至顯微鏡上觀察菌絲形態(tài)。將內(nèi)生真菌接種于產(chǎn)孢培養(yǎng)基，誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子后，置顯微鏡觀察并照相。

用真菌18S 通用引物，ITS1:(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4:(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系(20 μL):DNA 模板1 μL，10 ×Buffer 2 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)1.6 μL，ITS1 primer(10 μmol/L)0.4 μL，ITS4 primer(10 μmol/L)0.4 μL，HiFi(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O 14.4 μL。PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸40 s，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保溫。用凝膠回收試劑盒純化PCR 產(chǎn)物，克隆至PCR2.1 載體上，18S rDNA 序列由生物技術(shù)有限公司測(cè)定。將測(cè)得的18S rDNA 序列進(jìn)行BLAST 分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［4，5］。

1.7 拮抗菌株次生代謝產(chǎn)物的分離、純化、鑒定

內(nèi)生真菌E-19 發(fā)酵液20 L 減壓濃縮至2 L，用乙酸乙酯進(jìn)行多次萃取，萃取液減壓濃縮得到浸膏約26 g。用硅膠(80～100 目)拌樣，上正相硅膠柱(200～300 目，CHCl3/MeOH，100∶0～0∶100，V/V)粗分，得到5 個(gè)組份。組分1 經(jīng)反相中壓以甲醇-水(85∶15→0∶100)梯度洗脫，得到大量的化合物1(約2 g)。組分2 以石油醚-丙酮(5∶1→1∶1)梯度洗脫得化合物2(10 mg)。組分3 以石油醚-丙酮(5∶1→1∶1)梯度洗脫得亞組分，對(duì)亞組分經(jīng)反相-高效液相色譜法(RP-HPLC)制備柱色譜以(10%～30%，乙腈/水)得化合物4(2.1 mg)、5(12 mg)和6(6 mg)。化合物3(3 mg)來(lái)自于組分4，經(jīng)中壓反相柱層析(85%～100%甲醇)和半制備HPLC(70%～100%乙腈，20 min)分離得到。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 內(nèi)生真菌E-19 的鑒定

從馬鈴薯健康植株中分離得到一株對(duì)馬鈴薯晚疫病具有強(qiáng)烈拮抗作用的真菌E-19，經(jīng)3 種消毒有效性方法檢驗(yàn)，在其對(duì)照培養(yǎng)皿上未出現(xiàn)菌落，證明其為馬鈴薯內(nèi)生真菌。

圖1 E-19 菌絲在顯微鏡下的形態(tài)圖Fig.1 Morphology of endophytic fungi E-19 under microscope

圖2 內(nèi)生真菌E-19 的孢子在顯微鏡下的形態(tài)圖Fig.2 Fungal spores of endophytic fungi E-19 under microscope

圖3 基于18S rDNA 序列構(gòu)建的E-19 與其他真菌菌種的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Neighbour-joining tree based on 18S rDNA sequences showing relationships between strain E-19 and closely related members of fungi

內(nèi)生真菌E-19 在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)4 d 呈現(xiàn)黑褐色的菌落，直徑4.2 cm，背面黑褐色至黑色。氣生菌絲較發(fā)達(dá)，其菌絲和孢子在顯微鏡下的照片如圖1、圖2 所示。18S rDNA 序列分析表明內(nèi)生真菌E-19 與Bipolaris sorokiniana(最大相似度:100%;覆蓋度:95%;登錄號(hào):KJ909776.1)和Bipolaris eleusines(最大相似度:99%;覆蓋度:98%;登錄號(hào):KY909768.1)非常接近，其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。結(jié)合其菌絲形態(tài)特征和孢子特征，將其確定為Bipolaris eleusines。

2.2 內(nèi)生真菌E-19 次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 分子式C15H24O2，白色無(wú)定型粉末。1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:4.99 (1H，s，H-12)，4.70 (1H，s，H-12)，4.41 (1H，br s，H-14)，3.66 (1H，br s，H-15)，2.72 (1H，br s，H-1)，2.57(1H，br s，H-7)，1.76 (1H，br s，H-13)，1.55 (1H，m，H-9)，1.05 (3H，d，J=7.0 Hz，H-10)，0.99(3H，s，H-8)，0.93 (3H，d，J=7.0 Hz，H-11);13C NMR (CDCl3，150 MHz)δ:154.4 (C-2)，105.5 (C-12)，79.1 (C-14)，75.3 (C-15)，58.1 (C-1)，53.9(C-13)，46.0 (C-7)，43.0 (C-6)，40.3 (C-3)，37.2(C-4)，31.1 (C-9)，28.4 (C-8)，22.7 (C-5)，21.4(C-10)，21.0 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報(bào)道一致，故化合物1 鑒定為Isosativenediol。

化合物2 分子式C15H26O2，白色無(wú)定型粉末。1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:4.90 (1H，d，J=3.0 Hz，H-12)，4.79 (1H，d，J=3.0 Hz，H-12)，3.68 (1H，dd，J=11.0，6.0 Hz，H-15)，3.66 (1H，dd，J=11.0，6.5 Hz，H-14)，3.46 (1H，dd，J=11.0，9.0 Hz，H-15)，3.25 (1H，dd，J=11.0，9.0 Hz，H-14)，2.52 (1H，br t，J=8.0 Hz，H-1)，2.37(1H，s，H-7)，1.57 (1H，br t，J=8.0 Hz，H-13)，0.99 (3H，s，H-8)，0.96 (3H，d，J=7.0 Hz，H-10)，0.84 (3H，d，J=7.0 Hz，H-11);13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ:158.9 (C-2)，104.9 (C-12)，66.8 (C-14)，63.5 (C-15)，57.6 (C-7)，49.4 (C-1)，47.5 (C-3)，45.8 (C-13)，42.9 (C-4)，38.1(C-6)，30.9 (C-9)，25.2 (C-5)，21.6 (C-10)，20.9(C-11)，20.3 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報(bào)道一致，故化合物2 鑒定為Dihydroprehelminthosporol。

化合物3 分子式C15H24O2，白色無(wú)定型粉末。1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:10.03 (1H，s，H-15)，3.65 (1H，dd，J=10.8，5.4，H-14)，3.32(1H，dd，J=10.8，8.7 Hz，H-14)，3.19 (1H，br s，H-7)，2.00 (3H，s，H-12)，1.66 (1H，dd，J=8.0，5.0 Hz，H-13)，1.08 (3H，d，J=5.4 Hz，H-10)，1.02 (3H，s，H-8)，0.75 (3H，d，J=5.4 Hz，H-11);13C NMR (CDCl3，150 MHz)δ:188.7 (C-15)，167.0 (C-2)，137.3 (C-1)，62.1 (C-14)，61.1 (C-13)，50.8 (C-3)，44.8 (C-6)，41.1 (C-7)，34.2(C-4)，31.9 (C-9)，25.3 (C-5)，21.8 (C-10)，20.8(C-11)，18.4 (C-8)，10.8 (C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6，7］報(bào)道一致，故化合物3 鑒定為Helminthosporol。

化合物4 分子式C14H24O2，白色無(wú)定型粉末。1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:3.84 (1H，dd，J=10.7，5.1 Hz，H-12)，3.49 (1H，dd，J=10.7，7.1 Hz，H-12)，2.09 (1H，br q，J=7.1 Hz，H-14)，1.08 (3H，s，H-8)，1.01 (3H，d，J=6.6 Hz，H-10)，0.95 (3H，d，J=7.1 Hz，H-14)，0.81 (3H，d，J=6.6 Hz，H-11)，;13C NMR (CDCl3，150 MHz)δ:221.0 (C-1)，62.0 (C-12)，54.9 (C-2)，51.3 (C-7)，50.6 (C-13)，50.1 (C-6)，41.9 (C-3)，36.1(C-4)，29.9 (C-9)，26.0 (C-5)，22.0 (C-8)，21.4(C-10)，20.3 (C-11)，6.3 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報(bào)道一致，故化合物4 鑒定為Drechslerines C。

化合物5 分子式C14H24O2，白色結(jié)晶。1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:5.56 (1H，br d，J=1.5 Hz，H-1)，4.08 (1H，dd，J=14.3，1.1 Hz，H-12)，4.02 (1H，dd，J=14.3，1.5 Hz，H-12)，3.64 (1H，dd，J=10.6，5.3 Hz，H-14)，3.36 (1H，dd，J=10.6，9.4 Hz，H-14)，2.76 (1H，br s，H-7)，1.00(3H，s，H-8)，0.99 (3H，d，J=6.8 Hz，H-10)，0.89(3H，d，J=6.8 Hz，H-11);13C NMR (CDCl3，150 MHz)δ:147.2 (C-2)，124.2 (C-1)，63.9 (C-13)，62.7 (C-14)，60.0 (C-12)，47.7 (C-3)，45.5 (C-6)，43.9 (C-7)，35.8 (C-4)，33.9 (C-9)，26.5 (C-5)，21.7 (C-10)，21.4 (C-11)，19.1 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報(bào)道一致，故化合物5 鑒定為Drechslerine A。

化合物6 分子式C15H26O2，白色無(wú)定型粉末。1H NMR (CD3OD，600 MHz)δ:5.75 (1H，br s，H-1)，4.07 (1H，dd，J=14.9，1.7 Hz，H-12)，4.00(1H，dd，J=14.9，1.7 Hz，H-12)，3.65 (1H，m，H-15)，3.56 (1H，m，H-15)，2.02 (1H，m，H-13)，1.06(3H，s，H-8)，0.97 (3H，s，H-10)，0.98 (3H，s，H-11);13C NMR (CD3OD，150 MHz)δ:147.9 (C-2)，128.3 (C-1)，62.1 (C-15)，59.8 (C-12)，58.9 (C-9)，51.4 (C-3)，47.1 (C-13)，45.8 (C-4)，42.8(C-6)，36.7 (C-7)，35.2 (C-14)，32.7 (C-10)，28.0 (C-11)，22.3 (C-8)，21.9 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報(bào)道一致，故化合物6 鑒定為Secolongifolene diol。

3 結(jié)論

隨著人們對(duì)環(huán)境污染、食品安全和人類自身健康的重視，以及抗藥菌株的出現(xiàn)，尋找新的具有抑菌活性的天然產(chǎn)物已成為農(nóng)藥及抗生素領(lǐng)域的重要課題。植物內(nèi)生真菌在與宿主植物協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，能夠合成活性物質(zhì)協(xié)助宿主抵御外來(lái)病原菌的侵染。本課題以采自大理、德宏、臨滄三地的馬鈴薯健康植株為材料，分離內(nèi)生真菌。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和18S rDNA 序列分析結(jié)果，將菌株E-19 鑒定為B.eleusines。為了進(jìn)一步探索其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，我們從B.eleusines的發(fā)酵液中分離出6 個(gè)Sativene 骨架類型的倍半萜類化合物，均是首次從該菌中分離得到。本研究將為馬鈴薯內(nèi)生真菌活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)奠定化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 Schulz B，Boyle C.The endophytic continuum.Mycol Res，2005，109:661-686.

2 Lu SY (魯素云).Biological Control of Plant Diseases (植物病害生物防治學(xué)).Beijing:Beijing Agricultural University Press，1993，243-254.

3 Wang JH (王家和).Isolation and screening of antagonistic fungi against tobacco root diseases.Chin J Biol Control(中國(guó)生物防治)，1998，14:28-31.

4 White TJ，Bruns TD，Lee SB.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.In:Innis MA，Gelfand DH，Sninsky JJ，White TJ，eds.PCR protocols:a guide to methods and applications.San Diego:Academic Press，1990，315-322.

5 Ko Ko TW，Stephenson SL，Bahkali AH，et al.From morphology to molecular biology:can we use sequence data to identify fungal endophytes?Fungal Divers，2011，50:113-120.

6 Pena-rodriguez，LM，Armingeon NA，Chilton WS.Toxins from weed pathogens，I.phytotoxins fromAbipolaris pathogenof Johnson grass.J Nat Prod，1988，51:821-828.

7 Osterhage C，K?nig GM，H?ller U，et al.Rare sesquiterpenes from the Algicolous fungusDrechslera dematioidea.J Nat Prod，2002，65:306-313.