吳茱萸堿不同加藥時序對胃癌SGC7901 細胞放射敏感性的影響

漢媛媛 ，張凱亮，高雪翔，李 潔，3，郭 琪，Juraev Firdavs，王 靜*

1蘭州大學口腔醫學院，蘭州 730000;2 甘肅省婦幼保健院，蘭州 730050;3 天津高等醫學專科學校，天津 300222

胃癌是我國常見腫瘤之一，惡性程度較高，生長快，浸潤性強，轉移率高，預后較差［1］。目前治療提倡以手術、放射、化療為主，但是放射治療往往因其對正常組織的損傷，以及腫瘤組織對放射的抵抗限制了其臨床應用［2］。作為增加腫瘤放射敏感性、提高放射治療療效的重要手段，應用放射增敏劑成為提高放射治療增益比的重要手段。

吳茱萸堿(evodiamine，EVO)是蕓香科植物吳茱萸近成熟果實中提取的純天然化學成分，主要藥理作用有抗炎，抗血小板凝集，鎮痛，體溫調節等［3］。近年來眾多體內外研究表明EVO 對宮頸癌［4］、肺癌、結腸癌［5］、肝癌［6］等多種腫瘤具有抑制其生長的作用，前期實驗證實EVO 對舌鱗狀細胞癌Tca8113 細胞有放射增敏的作用［7］，為了進一步研究EVO 對其他腫瘤細胞是否也具有放射增敏作用，并且探討聯合作用中不同的加藥順序對放射敏感性的影響是否存在差異，研究選用胃癌SGC7901 細胞，探討EVO 聯合射線對SGC7901 細胞放射敏感性的影響，并初步探討其可能的機制，以期為胃癌臨床放射增敏劑的選擇提供基礎研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

EVO 購自天津化標生物技術有限公司;RPMI-1640 培養基購自美國Gbico 公司;新生牛血清購自四季青公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)，吉姆薩染液為武漢凌飛生物科技公司產品，碘化嘧啶(PI)購自上海生工公司;Caspase3 兔抗人多克隆抗體購自英國Abcam 公司;β-actin 兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 購自北京碧云天公司。

1.2 細胞培養

胃癌SGC7901 細胞(蘭州大學第一醫院中心實驗室提供)培養于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養液中，另加2.2 mg/L 碳酸氫鈉，1000000 U 鏈霉素，800000 U 青霉素。置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。

1.3 吳茱萸堿的配制

用DMSO 溶解EVO 并用RPMI-1640 將其配制成1000 μmol/L 的儲存液，使用時用RPMI-1640 稀釋成所需濃度，最終濃度分別為1、4、16 μmol/L。DMSO 濃度小于0.5%。

1.4 MTT 法檢測細胞增殖抑制率

實驗分組:(1)對照組(C):未作處理的SGC7901 細胞;(2)單獨加藥組(E):EVO 組;(3)單獨放射組(R):2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy;(4)聯合作用組(R+E):EVO 與放射線聯合作用組，其中聯合作用組又分為(A 組):放射前24 h 加藥;(B 組):放射后立即加藥。將對數生長期的SGC7901 細胞用0.25%的胰酶消化后重懸于培養液中，以1.5 ×104個/mL 的密度均勻接種于96 孔板內過夜。次日分別加入EVO，使藥物終濃度分別為1 μmol/L、4 μmol/L、16 μmol/L、每孔總體積為200 μL，每個濃度設置5 個復孔。EVO 作用24、48、72 h 后加入MTT 20 μL/孔，置于37 ℃、5%CO2培養箱4 h，棄去培養液，加入DMSO 150 μ/孔，振蕩混勻后于酶標儀測定570 nm 波長處的吸光度。確定EVO 濃度及作用時間后，聯合不同劑量射線(ELEKTA recise 醫用直線加速器的6 MV X 射線，放射野為40 cm×40 cm。放射源與培養瓶細胞面距離為100 cm，加入1.5cm 等效組織充填物)處理SGC7901 細胞。實驗重復3 次以上，取平均值。細胞增殖抑制率=(1-實驗藥物組OD 值/空白對照組OD 值)× 100%。

1.5 平板克隆形成實驗

取對數生長期的SGC7901 細胞進行相應處理后按照對照組200 個/孔，單獨放射組及聯合作用組400 個/孔，接種于6 孔板中，置于孵箱中繼續常規培養，待有肉眼可見克隆時，終止培養，PBS 沖洗，甲醇固定，Gmisa 染色，顯微鏡下計數大于50 個細胞的集落數。接種率PE(plating efficiency)=(對照組細胞克隆數/細胞接種數) ×100%;存活分數SF(surviving fraction)=實驗組克隆數/(細胞接種數×PE);采用單擊多靶模型擬合細胞存活曲線得出放射生物學敏感參數Do 值(mean lethal dose)=1/K 及Dq 值(quasithreshold dose)=Do × lnN (extrapolation number)，根據公式:放射增敏比SER(sensitizing enhancement ratio)=單獨放射組Do 值/增敏劑+放射組的Do 值，求出放射增敏比。

1.6 流式細胞儀檢測EVO 聯合放射線對胃癌細胞周期分布的影響

收集各組細胞，PBS 洗滌2 次，棄上清，加入體積分數為70%的乙醇振蕩混勻后固定30 min，離心棄上清，加入100 μL 的PI 染料，振蕩混勻后室溫避光染色30 min，用BD 流式細胞儀(FACSCalibur，美國)進行分析。

1.7 Western blot 檢測caspase 3 蛋白

收集各組細胞，冰上裂解細胞(RIPA 強裂解液，碧云天，PMSF 10 μL/ mL)30 min，提取總蛋白，BCA 法測定總蛋白濃度。細胞總蛋白于95 ℃條件下變性5 min 后，取20 μg 上樣。SDS-PAGE 恒壓80 V 分離蛋白，隨后在恒流300 mA 條件下進行常規濕轉1 h，PVDF 膜在搖床上室溫封閉60 min、4 ℃條件下caspase 3 一抗孵育過夜，TBST 洗膜10 min、3 次，室溫下搖床孵育二抗2 h，TBST 洗膜10 min、3 次，ECL 化學發光，顯影、定影，膠片曝光。β-actin 為內參照。

1.8 統計學方法

所有實驗重復3 次以上，采用SPSS16.0 軟件，細胞增殖率，周期分布采用T 檢驗分析，克隆形成實驗采用origin Pro8 軟件擬合細胞存活曲線，檢驗水準=0.05，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 EVO 單獨及聯合放射線抑制SGC7901 細胞的增殖

不同濃度的EVO 作用不同時間對細胞增殖的影響如圖1 所示，隨著作用濃度的增加及作用時間的延長，其對SGC7901 細胞增殖抑制率升高，EVO對SGC7901 細胞的生長抑制作用有明顯的時間依賴性和濃度依賴性。1 μmol/L EVO 處理48 h 對SGC7901 細胞抑制率為15.2% (IC15)，為了避免EVO 單獨使用對細胞產生的較強的抑制作用，選擇1 μmol/L 藥物濃度作為EVO 聯合放射線的工作濃度，作用時間為48 h。隨著放射劑量的增加，對細胞增殖的抑制率增加，且較單獨放射組及單獨加藥組有明顯的抑制作用，其中聯合作用A 組對細胞的抑制效果要優于聯合作用B 組(P＜0.05)，見圖2。

圖1 EVO 對SGC7901 細胞生長的抑制率Fig.1 SGC7901 cell survival rates after treated with EVO with different concentrations and time

圖2 EVO 聯合放射線對SGC7901 細胞生長的抑制率Fig.2 SGC7901 cell survival rates after treated with combination group

2.2 EVO 對SGC7901 細胞具有放射增敏作用

根據公式計算細胞存活分數(SF)，按單擊多靶擬合并繪制細胞的存活曲線。SGC7901 細胞經單獨放射和聯合作用后的存活曲線見圖3，放射生物學敏感參數見表1，放射增敏比見表2。聯合作用組各劑量點的存活分數、放射生物學敏感參數均低于單獨放射組，其中聯合作用A 組的放射增敏效果要優于聯合作用B 組(P＜0.05)。

圖3 單擊多靶模型擬合細胞的劑量存活曲線Fig.3 The dose survival curves of SGC7901 cells by muititarget single hit model

表1 單獨放射線及EVO 聯合放射線組的放射生物學敏感參數Table 1 Radiobiology sensitive parameter

表2 SGC7901 細胞放射增敏比Table 2 SER of SGC7901

2.3 EVO 聯合射線影響SGC7901 細胞周期分布

EVO 聯合放射組與對照組及單獨放射組相比，細胞處于G2/M 期的比例顯著增加，其中聯合作用A 組對SGC7901 細胞G2/M 期的阻滯大于聯合作用B 組，見圖4(P＜0.05)。相關研究已證實，細胞對放射線的敏感性增強與細胞G2/M 期阻滯有關G2/M 期的細胞對放射線敏感性最高［8］。

圖4 EVO 聯合放射線對SGC7901 細胞周期G2/M 期的阻滯率Fig.4 The rates of G2/M in different groups

2.4 EVO 聯合放射上調了SGC7901 細胞中凋亡蛋白caspase3 的表達

Western blot 結果顯示聯合作用組相對于單獨放射組及單獨加藥組，細胞凋亡蛋白caspases3 表達上調，其中聯合作用A 組較聯合作用B 組Caspase3表達量上調更明顯，且隨放射劑量的增加其表達量逐漸增加見圖5。

3 討論

圖5 Western blot 法檢測SGC7901 細胞中caspase3 蛋白表達Fig.5 Effects of different groups on the protein level of SGC7901 cell

細胞增殖抑制試驗結果表明，EVO 對胃癌SGC7901 細胞具有明顯的增殖抑制作用，且抑制作用呈劑量和時間依賴性。為了研究低濃度EVO 的放射增敏作用，研究選用了EVO IC15的劑量1 μmol/L，作為后續聯合作用的藥物劑量。MTT 實驗結果提示，EVO 聯合不同劑量射線在48 h 對SGC7901 細胞增殖的抑制率顯著高于單獨放射組和單獨用藥組，其中聯合作用先加藥A 組較聯合作用后加藥B 組對胃癌細胞的增殖抑制作用更強(P＜0.05)，提示EVO 聯合放射線降低了胃癌細胞的存活率，且先加藥的作用方式更利于殺傷細胞。Do 為平均致死劑量，反映不同細胞對放射線的敏感性;Dq 為準域劑量，反映細胞亞致死放射損傷的修復能力;SF2 可衡量細胞內在放射敏感性。克隆形成實驗結果顯示EVO 聯合放射線組的SF2、Do、Dq 均低于單獨放射組，提示EVO 增強了SGC7901 細胞對放射線的敏感性，并且不同加藥順序對放射敏感性的影響不同，先加藥使胃癌細胞對射線的敏感性更強。

放射增敏劑是一種與射線共同使用時可提高射線殺傷作用的藥物，常用的放射增敏劑可以從多種途徑實現其增敏效果，主要包括:增加射線對腫瘤細胞的原發性損傷，減弱放射后細胞亞致死性損傷的修復，改變細胞周期，促進凋亡，以及影響信號轉導通路等［9］。EVO 是一種從蕓香科植物吳茱萸近成熟果實中提取的天然藥物，具有副作用小，藥效廣泛等優勢，前期實驗證實EVO 可增強舌鱗狀細胞癌Tca8113 細胞的放射敏感性［7］。本研究進一步證明了EVO 同樣能夠對胃癌SGC7901 細胞產生放射增敏作用，并且加藥順序的不同影響著聯合作用的效果。

流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示EVO 對SGC7901 細胞有明顯細胞周期阻滯作用，且聯合作用組對細胞G2/M 期的阻滯率高于單獨放射組和單獨用藥組。細胞對放射線的敏感性增強與細胞G2/M 期的阻滯有關［10］，細胞處于該時期更易受到放射線的傷害，最終導致死亡。EVO 對胃癌SGC7901 細胞周期阻滯可能是EVO 產生放射增敏作用的機制之一，與前期研究EVO 對口腔癌細胞的放射增敏作用研究結果相似［7］。

細胞凋亡與細胞的生長，增殖和分裂緊密聯系，并且在許多疾病的發生過程中起著重要的作用［11］。caspase3 是細胞凋亡途徑中的經典下游基因。細胞在接收到外界凋亡信號刺激后引發一系列凋亡信號的激活，分為細胞外途徑(或稱細胞表面死亡受體途徑)和細胞內途徑(或稱線粒體引發途徑)，而在內外兩條凋亡途徑的級聯反應中都會伴隨著caspase 家族基因的激活，caspase3 是這些途徑中較為重要的基因，該基因的活化可最終導致細胞的凋亡［12］。Western blot 結果顯示，聯合作用組與單獨放射組和單獨用藥組相比，caspase3 的表達量明顯增多，其中聯合作用組中不同加藥時序對caspase3表達量的影響不盡相同，聯合作用組中先加藥A 組中凋亡蛋白capase3 的表達量高于后加藥B 組。凋亡蛋白表達量的增多說明EVO 與射線聯合使用可能激活了凋亡途徑中的相關基因最終導致caspase3基因的激活，亦或是直接使caspase3 活化，發揮其促凋亡的作用，從而使癌細胞死亡率升高。

綜上所述，EVO 聯合放射治療能增強胃癌SGC7901 細胞的放射敏感性，導致細胞增殖受到抑制，改變細胞周期分布，增加凋亡蛋白caspase3 的表達量，同時發現加藥順序的不同也影響著胃癌細胞對聯合作用不同的響應，這對胃癌圍手術期放射治療中增敏劑給藥順序選擇提供了一定的理論基礎數據，但EVO 的作用劑量、作用時間及具體的作用機制等還有待于進一步體內、體外實驗及臨床試驗的證實。

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