荷葉黃酮對乳酸桿菌和雙歧桿菌抗氧化能力的協同作用研究

劉雙環，李 歡，王 聰，梁 博，胡夏韻，韓 蓓，2*

1西安交通大學醫學部;2 陜西省營養與食品安全工程研究中心，西安 710061

近年來，益生菌制品、腸道益生菌制劑等在日常生活及臨床營養中發揮越來越積極的作用。益生菌不僅可以改善食品風味、提高營養價值，還具有特殊的應用價值，例如調整腸道菌群、增強腸道免疫力、抗氧化、調節血脂血糖等。目前國內外對益生菌的功能研究也日趨豐富，而對其作用機理的研究仍然是核心問題［1］，其中抗氧化作用及機制仍在探索中［2，3］。已有的研究表明，益生菌的抗氧化作用主要集中在細胞內，依靠抗氧化成分和氧化還原調控系統起作用［4，5］。

荷葉屬國家衛生部公布的既是食品又是藥品的植物，具有抗氧化、降血脂、抑菌消炎等功效。其生物活性和生理功能主要與含有的生物堿、黃酮類等功能性成分有關［6］。黃酮類化合物是色原酮或色原烷的衍生物，屬于植物次級代謝產物，也成植物化學物，是許多藥食兩用植物中的主要活性成分，具有顯著的降血脂和減肥、抗氧化、抗病毒、抑菌等作用［7-9］。荷葉黃酮抗氧化作用集中報道在其具有體外清除自由基，抗脂質過氧化等作用，在動物實驗中，可以提高衰老模型小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力［10，11］。

本實驗在益生菌在體內抗氧化研究及荷葉黃酮體外抗氧化研究的基礎上，研究荷葉黃酮對益生菌的生長促進作用，對益生菌體外抗氧化活性的協同促進作用。動物雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌分別在添加/無添加荷葉黃酮的培養基中進行培養，通過分別比較雙歧乳桿菌、保加利亞乳桿菌的生長曲線、細胞裂解物的體外抗氧化能力(包括清除超氧陰離子能力、清除DPPH 自由基能力、對脂質過氧化抑制作用)以及細胞內GSH、SOD 活性，探究荷葉黃酮對兩種益生菌抗氧化作用的協同影響［12，13］。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基及所用試劑

動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalisB211)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricusA105)為本實驗室保存。使用前先用12%的脫脂乳培養基活化2～3 次，然后5%的接種量轉接至MRS 培養基(10.0 g/L 蛋白胨、10.0 g/L 肉膏、5.0 g/L 酵母浸粉、20 g/L 葡萄糖、2.0 g/L 磷酸氫二鉀、2.0 g/L 檸檬酸氫二銨、5.0 g/L 乙酸鈉、0.58 g/L 硫酸鎂、0.25 g/L 硫酸錳、0.5 g/L 半胱氨酸、1.0 g/L 吐溫80，pH 6.2～6.4)中，置于厭氧手套培養箱(COY，US)中培養。

試劑:荷葉黃酮(純度15%，干粉)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、FeSO4、H2O2、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、HCl、甲醇等試劑，均為國產分析純試劑。SOD 和GSH 檢測試劑盒(南京凱基生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養和細胞破碎液的制備

動物雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌種在12%的脫脂乳粉培養基中活化三次，荷葉黃酮溶解于50%乙醇中，0.22 μm 的濾器過濾除菌，制備0.25 g/mL 的荷葉黃酮溶液(前期實驗證實0.25 g/mL 的荷葉黃酮對動物雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌的生長具有最佳的促進作用)。將動物雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌分別以5%的轉接量接種至MRS(含2.5 mg 荷葉黃酮)培養基、MRS 培養基中，保加利亞乳桿菌于42℃條件下培養20 h 左右，動物雙歧桿菌于37 ℃條件下厭氧培養20 h 左右。

將菌培養液于4500 rpm 離心10 min，收集菌體，用PBS 緩沖液洗滌2 次，將菌體重懸于PBS 緩沖液中，調整細胞總數至相等(基于OD600值)。然后經超聲波細胞粉碎機在冰浴條件下進行破碎(工作參數:功率400 W、全程時間10 min、工作5 s、間歇5 s)，菌破碎裂解液于4 ℃，7500 rpm 離心10 min，收集上清液備用。樣品組為經MRS 培養基、MRS+0.25 mg/mL 荷葉黃酮培養的動物雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌的菌體裂解液，對照組為MRS 空白培養基和添加0.25 mg/mL 荷葉黃酮的MRS 培養基。

采用鄰苯三酚自氧化法測定其抗氧化能力。取4.5 mL 0.1 M Tris-HCl 緩沖液(pH 8.2)于試管中，依次加入1.0 mL 1.0 mM 乙二胺四乙酸(EDTA)、1.0 mL 樣品組或對照組裂解液、2.4 mL 蒸餾水。于25 ℃水浴反應10 min，再加入2.0 mL 9.0 mM 鄰苯三酚準確反應60 min 后，加入100 μL 12.0 M HCl 終止反應。在波長325 nm 處測定吸光度A325樣品、A325對照。空白管以1.0 mL 蒸餾水代替樣品，操作方法同樣品管，每個樣品設3 個重復，測得吸光度A325空白。

1.2.3 益生菌細胞裂解物清除DPPH 自由基能力的測定

細胞破碎液離心后取上清液1.0 mL，加入濃度為0.2 mM 的DPPH·甲醇溶液1 mL，混勻后在室溫下避光反應30 min，離心后取實驗組合對照組上清液在517 nm 下測定光密度值A517樣品、A517對照，以PBS 緩沖液作空白對照，每個樣品設3 個重復，操作方法同樣品管，測得吸光度A517空白，按照下式計算菌株清除DPPH 自由基的能力。

1.2.4 益生菌細胞裂解物對脂質過氧化抑制作用

以卵黃脂蛋白為底物的反應體系包括:1:40 稀釋的卵黃懸液(卵黃用等體積的pH 7.45、0.1 M 的PBS 配成，用前先磁力攪拌10 min)0.2 mL、25 mM的FeSO4溶液0.2 mL、細胞破碎液100 μL，用PBS溶液補足2.0 mL。對照管除不加細胞破碎液其它試劑同前并提前加入20% TCA 溶液0.5 mL。試驗開始將上述兩種試管同時置37 ℃水浴中振蕩15 min，取出后，樣品試管加入20% TCA 溶液0.5 mL，靜置10 min 后，與對照管于3500 rpm 離心10 min，取實驗組和對照組上清液，分別加入硫代巴比妥酸(TBA，0.8%)溶液1.0 mL，加塞于100 ℃水浴15 min，取出冷卻。每個樣品設3 個重復，以空白管調零(空白以2.0 mL PBS 溶液代替)，測定A532樣品、A532對照和A532空白，細胞破碎液對卵黃脂蛋白LPO的抑制率(%)表示為:

1.2.5 益生菌細胞裂解物的GSH 和SOD 酶活測定

GSH 含量和SOD 活性測定均使用檢測試劑盒測定，按說明書操作。每個樣品設3 個重復。

1.3 數據處理

采用Excel 2003 和SPSS 13.0 數據統計軟件處理實驗數據。

2 實驗結果

2.1 益生菌細胞裂解物體外抗氧化能力

在MRS+0.25 mg/mL 荷葉黃酮的空白培養基上清對的清除率為14.3%。在MRS 培養基和MRS+0.25 mg/mL 荷葉黃酮培養基中，動物雙歧桿菌對的清除率分別為25.91%和40.14%，而保加利亞乳桿菌對的清除率分別為33.41%和38.36%。由本組實驗可看出:荷葉黃酮、動物雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌單獨均具有對的清除作用，而在MRS 培養基中添加0.25 mg/mL 荷葉黃酮的培養物中，動物雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌對的清除作用均有提高，分別提高了54.9% 和14.8%，動物雙歧桿菌的清除作用提高更明顯(圖1)。

圖1 有無添加荷葉黃酮至MRS 培養基對動物雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌細胞裂解液清除能力的影響Fig.1 The radical scavenging activity of B.animalis and L.bulgaricus cell lysate grown in the MRS medium supplied with and without lotus leaf flavonoids

2.1.2 清除DPPH 自由基的能力

在MRS+0.25 mg/mL 荷葉黃酮的空白培養基上清對DPPH 自由基的清除率為31.2%。在MRS培養基和MRS +0.25 mg/mL 荷葉黃酮培養基中，動物雙歧桿菌對DPPH 自由基的清除率分別為79.59%和71.91%，而保加利亞乳桿菌對DPPH 自由基的清除率分別為73.21%和77.70%。由本組實驗可看出:荷葉黃酮、動物雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌單獨均具有DPPH 自由基的清除作用。而在MRS 培養基中添加0.25 mg/mL 荷葉黃酮液的培養物中，保加利亞乳桿菌對DPPH 自由基的清除作用有所提高，動物雙歧桿菌對DPPH 自由基的清除作用稍有減低(圖2)。

圖2 有無添加荷葉黃酮至MRS 培養基對動物雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌細胞裂解液對DPPH 自由基清除能力的影響Fig.2 The DPPH radical scavenging activity of B.animalis and L.bulgaricus cell lysate grown in the MRS medium supplied with and without lotus leaf flavonoids

2.1.3 抗脂質過氧化的能力

在MRS+0.25 mg/mL 荷葉黃酮的空白培養基清除脂質過氧化率為11.8%。在MRS 培養基和MRS+0.25 mg/mL 荷葉黃酮培養基中，動物雙歧桿菌清除脂質過氧化率分別為54.47%和48.53%，而保加利亞乳桿菌清除脂質過氧化率分別為8.93%和58.73%。由本組實驗可看出:荷葉黃酮、動物雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌單獨均具有清除脂質過氧化作用。而在MRS 培養基中添加了0.25 mg/mL 荷葉黃酮液后，動物雙歧桿菌對脂質過氧化的清除作用稍有降低，而保加利亞乳桿菌對脂質過氧化的清除作用大幅提高，提高了557.6%(圖3)，荷葉黃酮對其的脂質過氧化清除能力呈現出顯著的協同貢獻作用。

圖3 有無添加荷葉黃酮至MRS 培養基對動物雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌細胞裂解液清除脂質過氧化能力的影響Fig.3 The inhibition effect on lipid preoxidation of B.animalis and L.bulgaricus cell lysate grown in the MRS medium supplied with and without lotus leaf flavonoids

2.2 益生菌細胞內的GSH 和SOD 測定

對在MRS 培養基和MRS+0.25 mg/mL 荷葉黃酮的培養基中培養的動物雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌進行了菌體內的SOD 酶活測定。SOD 活性的定義為每mg 細胞破碎液總蛋白在1 mL 反應體系內的SOD 抑制率達50%時所對應的SOD 量為1 個SOD 活力單位(U)。從圖4 可以看出荷葉黃酮的添加對兩種益生菌的胞內SOD 酶活均有所增加，動物雙歧桿菌的SOD 酶活提高了11.9%，保加利亞乳桿菌的提高了82.4%。

圖4 有無添加荷葉黃酮至MRS 培養基對動物雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌的SOD 酶活的影響Fig.4 The SOD enzyme activities of B.animalis and L.bulgaricus cell grown in the MRS medium supplied with and without lotus leaf flavonoids

對在MRS 培養基和MRS+0.25 mg/mL 荷葉黃酮的培養基中培養的動物雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌進行了菌體內的GSH 含量測定(圖5)。兩種益生菌的胞內均檢測到了GSH，而荷葉黃酮的添加可以提高兩種益生菌的胞內GSH 含量，動物雙歧桿菌的GSH 含量提高了50%，保加利亞乳桿菌的提高了76%。

圖5 有無添加荷葉黃酮至MRS 培養基對動物雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌的GSH 含量的影響Fig.5 The concentration of GSH in B.animalis and L.bulgaricus cell grown in the MRS medium supplied with and without lotus leaf flavonoids

3 討論與結論

既往研究表明，益生菌體內抗氧化作用主要有以下四部分［14-16］:(1)自由基的清除能力，主要包括對、DPPH、羥自由基等的清除能力。(2)氧化應激的耐受能力，主要指菌體在含有一定濃度的O2或H2O2培養基中正常生長的耐受力。(3)抗脂質過氧化的能力，主要是通過對亞油酸過氧化抑制率或脂質過氧化產物丙二醛(MDA)的含量進行測定來反映。(4)產生抗氧化物質，某些益生菌能夠產生如SOD、GSH-Px、CAT、NADH 氧化酶、金屬硫蛋白等特殊的活性物質，可依據其活性評估其抗氧化特性。而植物黃酮類物質也具有顯著的抗氧化能力，荷葉黃酮具有良好的清除DPPH 自由基的能力，且可以有效地抑制亞油酸氧化［17］;白茶黃酮、款冬花黃酮、紅花黃酮、旱蓮草黃酮等均對H2O2均具有較強的清除能力，并具有較強的抗脂質過氧化活性［18］。

益生菌、植物黃酮已經被廣泛應用于食品、醫藥、保健品等行業，而植物黃酮是否可促進益生菌的生長，是否對益生菌的抗氧化活性有協同增效作用，這方面的研究較少。本研究結果顯示荷葉黃酮僅對保加利亞乳桿菌抗脂質過氧化作用有明顯協同增效作用，而對自由基的清除能力上協同作用不明顯;荷葉黃酮對動物雙歧桿菌的抗脂質過氧化作用和DPPH 自由基的清除能力稍有降低，對自由基的清除能力上協同作用不明顯。可能是黃酮與抗氧化活性之間存在的一一對應關系有關，有待于從其組成、結構上進行研究和證明。

通過測定菌株內GSH、SOD 酶活，直接反應益生菌的抗氧化活性［19-22］。動物雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌胞內均可產生SOD、GSH，而荷葉黃酮的添加可以提高兩種益生菌的胞內SOD、GSH 酶活，而且保加利亞乳桿菌的SOD 酶活(提高了82.4%)和GSH 含量(提高了76%)增加遠遠大于動物雙歧桿菌的SOD 酶活和GSH 含量的增加。這可能與荷葉黃酮對保加利亞乳桿菌抗脂質過氧化作用有明顯協同增效作用有關，荷葉黃酮可以較為有效的提高保加利亞乳桿菌胞內SOD、GSH 酶活，從而提高其抗氧化及清除自由基的生物效應。

本研究結果提示我們可以考慮在益生菌發酵中添加荷葉粉/荷葉黃酮來提高其功能食品、保健食品的價值，但作為實際應用還有待于進一步研究。

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