長波紫外線對皮膚成纖維細胞表達和分泌組織蛋白酶G的影響

許慶芳 侯巍 賴維 鄭躍 劉晨 陸春

長波紫外線對皮膚成纖維細胞表達和分泌組織蛋白酶G的影響

許慶芳 侯巍 賴維 鄭躍 劉晨 陸春

目的研究長波紫外線(UVA)照射對皮膚成纖維細胞組織蛋白酶G(CatG)表達和分泌的影響。方法原代培養的皮膚成纖維細胞來自兒童包皮,10代以內的細胞行后續實驗。①以10 J/cm2UVA照射皮膚成纖維細胞,24、48、72 h后提取照射組和對照組細胞蛋白和mRNA,并收集細胞上清液;②分別以10、20、30 J/cm2UVA照射皮膚成纖維細胞,24 h后收集細胞和上清液。用RT-PCR和Western印跡分別檢測各組細胞CatG mRNA及蛋白的表達,ELISA檢測細胞上清液CatG的含量。結果 10 J/cm2UVA照射后24、48、72 h,照射組細胞CatG mRNA表達分別為0.376±0.014、0.308±0.022和0.296±0.032,對照組分別為0.183±0.003、0.185±0.005、0.182±0.004;照射組細胞CatG蛋白灰度值分別為1.80±0.12、1.41±0.17和1.27±0.09,對照組分別為0.96±0.06、0.95±0.22、1.00±0.14;照射組細胞CatG mRNA、蛋白表達及細胞上清液CatG含量較相應的對照組升高(均P＜0.05),且以照射后24 h表達最高。10、20、30 J/cm2UVA照射后24 h,皮膚成纖維細胞CatG mRNA表達分別為對照組的1.90、2.51、3.04倍,細胞CatG蛋白表達分別為對照組的1.88、3.97、4.72倍,細胞上清液CatG含量分別為對照組的1.36、1.50、1.66倍,均隨UVA劑量的升高而增加,其差異有統計學意義(均P＜0.01)。結論急性UVA照射促進皮膚成纖維細胞表達和分泌CatG。

成纖維細胞;組織蛋白酶類;紫外線;細胞衰老

有研究表明,組織蛋白酶G(cathepsin G,CatG)在光損傷皮膚和皮膚成纖維細胞中表達升高,可能通過降解真皮細胞外基質參與光損傷發生[1]。長波紫外線(UVA)可引起皮膚光損傷,但目前還未見UVA照射對皮膚成纖維細胞表達和分泌CatG影響的研究。本研究在體外用不同劑量UVA照射皮膚成纖維細胞,研究成纖維細胞CatG表達和分泌隨UVA劑量及照射后時間變化的規律,探討其在光損傷中的作用及機制。

材料與方法

一、材料

1.皮膚成纖維細胞組織來源:健康人皮膚組織來自于中山大學附屬第三醫院泌尿外科健康兒童包皮環切術后的包皮組織,所選人群年齡5～9歲,平均6歲。本研究經過中山大學附屬第三醫院倫理委員會批準(編號:中大附三醫倫[2010]2-22號),患者父母知情同意并簽署知情同意書。

2.試劑和儀器:DMEM(Dulbeccos modified eagle media)高糖培養基、胰酶、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青鏈霉素為美國Gibco公司產品。一抗兔抗人CatG IgG抗體由美國Abcam公司生產,內參兔抗人GAPDH多克隆IgG抗體、二抗HRP羊抗兔IgG為美國Cell signaling technology公司產品。BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)、ECL顯色試劑盒(美國Millpore公司)、預染Marker(加拿大Mbi fermentas公司)、總RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司)。Prime-script RT master mix逆轉錄試劑盒和Sybrpremix ex taqTM試劑盒為日本Takara公司產品。CatG ELISA檢測試劑盒為美國Biovision公司產品。UVA紫外線輻射儀(Sigmass-03A,燈管為Philips UVA TL10RS,波長320～400 nm)、UVA照射計(Sigma ss-03,2012年3月6日標定)均為上海希格瑪高科技有限公司產品;酶聯免疫檢測儀(美國Biotek公司);CO2細胞培養箱(美國Thermo scientific公司);Abi prism 7500型實時熒光定量PCR儀。

二、方法

1.原代皮膚成纖維細胞培養:取兒童包皮,參照文獻[2]分離培養皮膚成纖維細胞,第3代細胞凍存。細胞復蘇后10代以內的細胞行后續實驗。

2.UVA照射方法:將3～10代的成纖維細胞按1×106接種于6 cm的細胞培養皿,24 h后從培養箱取出,吸棄培養液,PBS洗2次后,每皿加入2 ml PBS。然后把培養皿置于UVA紫外線輻射儀下,距離紫外線光源約15 cm。用UVA照射檢測儀測得的平均照射功率為13 mW/cm2,分別照射769、1 538、2 307 s,使照射1次的UVA劑量分別達10、20、30 J/cm2。對照組細胞加入PBS后置于超凈臺避光。照射后立即吸棄PBS溶液,加入新鮮培養液,置于95%濕度、5%CO2、37℃培養箱中培養。

3.皮膚成纖維細胞及其培養液在10 J/cm2UVA照射后3 d CatG的變化:實驗分UVA照射組和無照射對照組。將成纖維細胞按上述方法予10 J/cm2UVA照射1次。在照射后24、48、72 h提取細胞RNA和蛋白及收集細胞培養上清液。

4.不同UVA劑量對皮膚成纖維細胞及其培養液CatG表達的影響:實驗設 10、20、30 J/cm2UVA照射組和無照射對照組。將成纖維細胞按上述方法分別予10、20、30 J/cm2UVA照射1次。在照射后24 h提取細胞RNA和蛋白及收集細胞培養上清液。

5.RT-PCR檢測皮膚成纖維細胞中CatG mRNA表達:按照Trizol試劑盒的方法提取各組細胞總RNA。按逆轉錄試劑盒說明書配制逆轉錄反應體系,總體積20 μl,然后37℃下反轉錄15 min,85℃5 s使反轉錄酶失活,即獲得cDNA,置-20℃冰箱中保存。采用染料法(SYBR GreenⅠ)進行相對定量分析。PCR反應體系共20 μl,包括SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 10 μl,ROXDyeⅡ 0.4 μl, 雙蒸水 6 μl,上游和下游引物各 0.8 μl和 cDNA 2 μl。兩步法實時定量PCR:95℃5 s,1個循環;95℃5 s,60℃30 s,40個循環。CatG上游引物序列5′-TCCAGAGTCCA GCAGGTCAGAG-3′,下游引物序列 5′-CTGGATGG TCCGCTGATTATATTG-3′,擴增片段長度200 bp。GAPDH上游引物序列5′-GCACCGTCAAGGCTGA GAAC-3′，下游引物序列 5′-TGGTGAAGACGCCAGT GGA-3′,擴增片段長度138 bp。在實時熒光定量PCR儀上讀取擴增曲線、熔解曲線和Ct值。重復3次實驗,結果取平均值,用2-ΔΔCt法計算目的基因和內參基因的表達相對值。

6.Western印跡檢測皮膚成纖維細胞中CatG蛋白表達:提取各組細胞總蛋白-80℃保存。BCA法蛋白定量。總蛋白經10%SDS-PAGE分離后,電轉移到PVDF膜上。一抗兔抗人CatG-IgG(1∶500),內參兔抗人GAPDH-IgG(1∶4 000),4℃孵育過夜,TBST液洗膜,加入HRP羊抗兔IgG(1∶1 000)37℃孵育1 h,TBST液洗膜,ECL顯色。以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值作為該目的蛋白相對表達量。

表1 10 J/cm2UVA照射后24 h、48 h、72 h皮膚成纖維細胞及其上清液中CatG表達(±s)

表1 10 J/cm2UVA照射后24 h、48 h、72 h皮膚成纖維細胞及其上清液中CatG表達(±s)

注:n=3

組別 細胞CatG mRNA(2-ΔΔCt) 細胞CatG蛋白(相對表達量) 上清液CatG(ng/L)24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h對照組 0.183±0.003 0.185±0.005 0.182±0.004 0.96±0.06 0.95±0.22 1.00±0.14 122.45±6.46 124.17±6.15 121.72±3.17 UVA組 0.376±0.014 0.308±0.022 0.296±0.032 1.80±0.12 1.41±0.17 1.27±0.09 161.35±7.55 141.76±2.95 139.63±3.04 t值 24.08 9.39 6.18 10.62 2.86 2.85 6.78 4.46 7.06 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

7.ELISA檢測皮膚成纖維細胞CatG分泌水平:以無血清培養基培養經UVA照射的細胞及對照細胞,在相應時間點收集細胞上清液,離心后-80℃保存備用。按照ELISA操作程序加樣品、標準品、一抗、酶標抗體、底物、終止液,然后在450 nm處測吸光度(A)。繪制標準曲線,根據各樣品的A值計算出CatG濃度。

結 果

一、10 J/cm2UVA照射后不同時間皮膚成纖維細胞表達及分泌CatG的變化

10 J/cm2UVA 照射后 24、48、72 h,皮膚成纖維細胞CatG mRNA表達均較相應對照組升高,差異有統計學意義(P＜0.05)。照射后24、48、72 h組CatG mRNA表達水平比較,F=10.18,P＜0.05,差異有統計學意義;LSD檢驗發現,24 h UVA組CatG mRNA表達均顯著高于48 h和72 h UVA組(P＜0.05),但48 h與72 h UVA組間差異無統計學意義(P＞0.05),以24 h UVA組CatG mRNA表達最高。見表1。

10 J/cm2UVA 照射后 24、48、72 h,照射組細胞CatG蛋白表達分別較相應對照組升高1.88、1.48、1.27倍,差異均有統計學意義(P＜0.05)。照射后24、48、72 h組CatG蛋白灰度值比較,F=12.74,P＜0.05);LSD檢驗發現,24 h與48 h組間(P＜0.05)、24 h與72 h組間(P＜0.05)差異均有統計學意義,但48 h與72 h組間(P＞0.05)差異無統計學意義,以24 h組CatG蛋白表達最高。見表1,圖1。

10 J/cm2UVA 照射后 24、48、72 h,照射組成纖維細胞培養上清液中CatG表達均分別較相應對照組升高(P＜0.05)。照射后24、48、72 h組表達水平比較,F=26.51,P＜0.05,差異有統計學意義;LSD分析發現,以照射后24 h組最高。見表1。

圖1 10 J/cm2UVA照射后24、48、72 h皮膚成纖維細胞CatG蛋白表達電泳圖 1、3、5:分別為24、48、72 h未照光對照組;2、4、6:分別為 24、48、72 h 照射組

二、不同劑量UVA照射后24 h皮膚成纖維細胞表達及分泌CatG的變化

10、20、30 J/cm2UVA 照射后 24 h,皮膚成纖維細胞中CatG mRNA表達分別為無照射對照組的1.90、2.51、3.04倍,均較對照組升高,并隨 UVA 劑量增加而升高,經ANOVA及LSD分析,其差異有統計學意義(P＜0.001);CatG蛋白分別較對照組升高1.88、3.97、4.72倍,也隨UVA劑量增加而升高,其差異有統計學意義(P＜0.01)。見表2,圖2。

表2 UVA呈劑量依賴性地促進皮膚成纖維細胞及其上清液CatG的表達(±s)

表2 UVA呈劑量依賴性地促進皮膚成纖維細胞及其上清液CatG的表達(±s)

注:n=3

組別 細胞CatG mRNA(2-ΔΔCt)上清液CatG(ng/L)對照組 0.259±0.003 0.69±0.07 120.56±4.76 10 J/cm2UVA組 0.492±0.002 1.30±0.02 163.69±5.22 20 J/cm2UVA組 0.651±0.001 2.74±0.04 181.04±5.11 30 J/cm2UVA組 0.788±0.002 3.26±0.08 200.31±7.65 F值 9264.54 436.97 103.30 P值細胞CatG蛋白(相對表達量)＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖2 不同劑量UVA照射后24 h皮膚成纖維細胞CatG蛋白表達電泳圖 1:未照光對照組;2～4:分別為10、20、30 J/cm2UVA照光組

10、20、30 J/cm2UVA 照射組細胞培養上清液CatG含量分別較無照射對照組升高1.36、1.50、1.66倍(均P＜0.001)。不同UVA劑量組之間相比差異也有統計學意義(P＜0.01),細胞培養上清液CatG含量隨UVA劑量的增加而升高。見表2。

討 論

有研究表明,蛋白酶是導致皮膚光損傷多種發病機制的共同環節,在光損傷發病機制中起重要作用[3]。目前蛋白酶研究主要集中于基質金屬蛋白酶(MMP)家族[4]。新近一些研究發現,除MMP與皮膚光損傷機制有關外,其他許多酶,如溶酶體組織蛋白酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、溶菌酶、中性粒細胞蛋白酶抑制劑(Elafin)及α1抗胰蛋白酶等也參與皮膚光損傷發生[5]。

組織蛋白酶G屬于組織蛋白酶家族的絲氨酸亞型,具有分解多種正常真皮連接成分(如Ⅰ型膠原纖維、層黏連蛋白、蛋白聚糖、纖維連接素)的生物功能[6]。CatG可能通過降解真皮細胞外基質參與光損傷[7]。Son等[8]外用CatG抑制劑于無毛雌性大鼠皮膚,結果其可增加UVB誘導大鼠光老化皮膚膠原含量。本研究以10 J/cm2UVA照射體外培養的皮膚成纖維細胞,在照射后24、48、72 h照射組細胞CatG mRNA、蛋白表達和上清液CatG含量均顯著高于相應無照射對照組,且以照射后24 h最高,表明UVA從基因和蛋白水平刺激皮膚成纖維細胞CatG表達,并促進細胞分泌CatG,照射后24 h,成纖維細胞表達和分泌的CatG可能開始下降。我們再分別以10、20、30 J/cm2UVA照射細胞,發現UVA呈劑量依賴性地刺激皮膚成纖維細胞表達和分泌CatG。我們的前期研究[1]也發現,光老化皮膚及皮膚成纖維細胞CatG mRNA和蛋白表達均較未老化對照組升高。Cavarra等[9]發現,UVA而非UVB可上調來源于暴光、非暴光部位的皮膚成纖維細胞CatG的活性。因此,UVA不僅能促進皮膚成纖維表達MMP,還刺激其表達、分泌CatG。

UVA通過降低皮膚成纖維細胞表面TβRⅡ表達下調轉化生長因子β(TGF-β)/Smad信號通路[10],而其產生的活性氧簇(ROS)激活皮膚成纖維細胞的3條信號通路:磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K-AKT)通路、NF-κB通路及MAPK通路[11]。UVA是否通過這些通路上調皮膚成纖維細胞CatG表達與分泌目前還不清楚。我們的研究已揭示,組織蛋白酶K在UVA照射后3 d體外培養皮膚成纖維細胞中表達升高[2],在光老化皮膚及皮膚成纖維細胞中表達卻降低[1],然而CatG在這兩者中均升高,表明UVA調控皮膚成纖維細胞組織蛋白酶K、G表達的機制不同。Son等[12]報道,CatG可通過分解真皮基質中的纖維連接素刺激皮膚成纖維細胞MMP的表達,并促進MMP前體轉化為活性形式。那么其他的酶是否調控CatG表達或UVA是否通過調控其他酶進而影響CatG表達,均有待研究。

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2014-03-18)

(本文編輯:顏艷)

Effect of ultraviolet A radiation on the expression and secretion of cathepsin G by human dermal fibroblasts

Xu Qingfang*，Hou Wei，Lai Wei，Zheng Yue，Liu Chen，Lu Chun.*Department of Dermatology，Third Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China

Lai Wei，Email:drlaiwei@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of ultraviolet A(UVA)radiation on the expression and secretion of cathepsin G(CatG)by human dermal fibroblasts.MethodsDermal fibroblasts were isolated from the foreskins of boys，and subjected to primary culture and subculture.After 10 or less passages，the fibroblasts were collected and divided into several groups to be irradiated with 10 J/cm2UVA followed by 24，48 and 72 hours of additional culture，or be irradiated with 10，20 and 30 J/cm2UVA followed by 24 hours of additional culture，with those receiving no treatment serving as the control group.Subsequently，cells and culture supernatant were collected，real time PCR and Western blot were performed to detect the expressions of CatG mRNA and protein respectively in these cells，and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was conducted to measure the expression of CatG protein in the culture supernatant of these cells.ResultsCompared with the control group，the fibroblasts irradiated with 10 J/cm2UVA showed a significant increase at 24，48 and 72 hours in the expressions of CatG mRNA(0.376± 0.014 vs.0.183± 0.003，0.308 ± 0.022 vs.0.185± 0.005，0.296± 0.032 vs.0.182± 0.004，respectively，allP＜0.05)and protein(1.80±0.12 vs.0.96±0.06，1.41±0.17 vs.0.95±0.22，1.27±0.09 vs.1.00±0.14，respectively，allP＜0.05)，as well as in the supernatant level of CatG protein((161.35±7.55)vs.(122.45±6.46)ng/L，(141.76 ± 2.95)vs.(124.17 ± 6.15)ng/L，(139.63 ± 3.04)vs.(121.72 ± 3.17)ng/L，respectively，allP＜0.05)，with the strongest increase observed at 24 hours.At 24 hours after 10，20 and 30 J/cm2of UVA radiation，the expression of CatG mRNA in irradiated fibroblasts was 1.90，2.51 and 3.04 times respectively(allP＜ 0.05)，the expression of CatG protein was 1.88，3.97 and 4.72 times respectively(P＜ 0.05)，and the supernatant level of CatG protein was 1.36，1.50 and 1.66 times respectively(P＜ 0.05)，that in the control group，and there was an increasing trend in all the above three parameters with increasing dose of UVA.ConclusionAcute UVA radiation can promote the expression and secretion of CatG by human dermal fibroblasts.

Fibroblasts;Cathepsins;Ultraviolet rays;Cell aging

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.012

國家自然科學基金面上項目(81171523);廣東省2012年第一批產業技術研究與開發資金計劃項目(2012B031800057);廣東省自然科學基金(10151008901000117);2011年CAD-資生堂DQ基金

510630廣州,中山大學附屬第三醫院皮膚科(許慶芳、賴維、鄭躍、劉晨、陸春);新疆醫科大學第一附屬醫院皮膚科(侯巍)

賴維,Email:drlaiwei@163.com