過表達表皮生長因子受體對人類黑素瘤腦轉移瘤細胞系H1生長和轉移的影響

康晶 Hrvoje Miletic 郭淑蘭

過表達表皮生長因子受體對人類黑素瘤腦轉移瘤細胞系H1生長和轉移的影響

康晶 Hrvoje Miletic 郭淑蘭

目的探索表皮生長因子受體(EGFR)在黑素瘤生長和轉移過程中的作用。方法選用本實驗室已建立的人黑素瘤腦轉移瘤細胞系(H1),通過慢病毒載體穩定轉染野生型EGFR(H1EGFRwt),使其呈EGFR過表達狀態,對照組轉染綠色熒光蛋白(H1GFP)后分選純化。采用細胞劃痕實驗對實驗組H1EGFRwt細胞和對照組H1GFP細胞的遷移能力進行分析,結果以劃痕面積愈合率表示。采用集落形成實驗觀察EGFR對兩組細胞獨立生存能力和集落形成能力的影響,通過刃天青還原試驗評估集落形成結果,結果以兩組細胞活細胞數及其代謝活性評分表示。Western印跡分析EGFR激活的信號通路。采用SPSS 20.0軟件進行重復測量的方差分析比較兩組細胞劃痕面積愈合率的差異,采用配對樣本t檢驗比較兩組細胞不同預處理的代謝評分差異。結果流式細胞儀檢測顯示,H1細胞EGFR和GFP轉染成功,分選后得到了純化H1EGFRwt和H1GFP細胞。細胞劃痕實驗顯示,實驗組H1EGFRwt在給予表皮生長因子(EGF)刺激的不同時間點(6、18、24、48 h),劃痕面積愈合率分別為0.145±0.066、0.479±0.096、0.571±0.198、0.672±0.199,對照組H1GFP在相同條件下分別為0.051±0.036、0.254±0.038、0.303±0.077和0.498±0.111,H1EGFRwt細胞的愈合程度均高于H1GFP細胞,兩組比較,F=68.49,df=5,P＜0.05。集落形成實驗證實,H1EGFRwt細胞的代謝評分(92 225.2±6 632.1)高于H1GFP細胞(62 935.7±8 159.2),兩組比較,t=2.26,df=9,P＜0.01。Western印跡結果顯示,H1EGFRwt細胞可在EGF的刺激下激活下游信號磷酸化磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C-γ(pPLCγ)、磷酸化信號轉導和轉錄活化因子5(pSTAT 5)、磷酸化信號轉導和轉錄活化因子3(pSTAT3),而對照組未能激活。此外,H1EGFRwt細胞可在EGF刺激下使磷酸化絲/蘇氨酸蛋白激酶(pAKT)和磷酸化有絲裂原活化蛋白激酶(pMAPK)表達明顯高于對照組。結論EGFR在黑素瘤H1細胞的轉移機制中發揮重要作用,并有可能成為黑素瘤轉移治療中的靶向目標。

黑色素瘤;受體,表皮生長因子;表皮生長因子

黑素瘤是一種具有高度侵襲及轉移性的惡性腫瘤,目前,首選治療方案仍然是手術切除,但是治愈率很大程度上要取決于是否能早期診斷[1]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一種具有酪氨酸激酶活性的膜受體,可被表皮樣生長因子如表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和轉化生長因子α(transforming growth factor-α,TGF-α)等激活,隸屬于 ErbB 受體家族,這個家族還包括ErbB2(HER2 or Neu)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)三個成員[2]。EGFR被證實與很多人類腫瘤的發生發展及不良預后有關[3],也參與了黑素瘤的發展與轉移。我們通過創傷愈合實驗和集落形成實驗探索EGFR對黑素瘤細胞轉移及獨立存活能力的影響,采用Western印跡研究EGFR激活的信號通路,尋找有可能成為黑素瘤轉移治療中的理想靶點。

材料和方法

一、細胞培養和試劑

人黑素瘤腦轉移瘤細胞系H1的描述見文獻[4],培養基為DMEM(美國Sigma公司)并添加8%～10%胎牛血清,320 μg/L L谷氨酰胺,100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素。磷酸化絲/蘇氨酸蛋白激酶(pAkt)、磷酸化磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C-γ(pPLCγ)、磷酸化信號轉導和轉錄活化因子 5(pSTAT 5)、磷酸化信號轉導和轉錄活化因子3(pSTAT 3)、磷酸化有絲裂原活化蛋白激酶(pMAPK)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗(美國Cell Signaling Technology公司),山羊抗兔二抗(美國Vector Laboratories公司),綠色熒光蛋白(GFP,美國Proteintech Group公司),刃天青鈉鹽、低熔點瓊脂糖、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)(美國Sigma公司),磷酸鹽緩沖液(PBS)、EGF(美國Peprotech公司),Difco Noble瓊脂(美國BD公司),BCA蛋白測定試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

二、流式細胞儀檢測

流式細胞儀(型號為Acurri C6)分析H1細胞中EGFR的表達。實驗組H1細胞采用慢病毒載體轉染野生型EGFR,對照組轉染GFP。流式細胞儀(型號:FACS Aria)對細胞進行純化和分選,得到EGFR過表達的H1EGFRwt細胞和對照組的H1GFP細胞。

三、細胞劃痕實驗

H1EGFRwt和H1GFP細胞接種在24孔板中并于培養箱中培養24 h,直至細胞達100%匯合。然后將細胞進行饑餓處理,無血清培養基中培養24 h。用微量移液器槍頭沿單層細胞劃過,PBS洗滌2次以除去細胞碎片,加入20 μg/L EGF繼續培養。0、6、18、24和48 h時在顯微鏡下拍照,通過Cell Profiler軟件測量劃痕面積。結果以劃痕面積愈合率表示,劃痕面積愈合率=(0 h時劃痕面積-各時間點的劃痕面積)/0 h時劃痕面積。

四、集落形成實驗

2.4%Difco Noble瓊脂與細胞培養液1∶3混合制備底層瓊脂,2.4%低熔點瓊脂糖和預熱的細胞培養液同樣1∶3混合制備上層瓊脂。單層細胞懸液調整到8×104個/ml,與制備好的上層瓊脂等體積混合,于37～38℃保存。先以每孔50 μl體積的底層瓊脂加入到96孔板中,每組10個孔,其上覆蓋同體積的瓊脂糖/細胞懸液,最后每孔加入100 μl細胞培養液。將96孔板置于培養箱中培養10 d。10 d后上機檢測,采用Workout 2.0檢測其活細胞數及代謝活性并進行評分。之后采用刃天青還原試驗評估集落形成結果,每孔加入0.1 g/L刃天青溶液20 μl,培養箱中4 h孵育后,再次上機檢測兩組細胞的活細胞數及代謝活性并進行評分,其代謝評分用來反映細胞集落形成實驗結果。

五、Western印跡

H1EGFRwt和H1GFP細胞饑餓培養24 h,加入20 μg/L的EGF[5]刺激細胞生長30 min后提取總蛋白,并用BCA蛋白測定試劑盒檢測總蛋白濃度。將等量樣品通過SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜。分別加入不同濃度一抗4℃孵育過夜,清洗后二抗室溫孵育1.5 h。GAPDH用作內參照。

六、統計學處理

采用SPSS 20.0進行統計分析,重復測量的方差分析比較兩組細胞劃痕面積愈合率的差異,配對樣本t檢驗比較兩組細胞不同預處理的代謝評分差異,P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、H1細胞系的EGFR表達

圖1 H1細胞轉染前后表皮生長因子受體(EGFR)表達情況 1a:轉染前H1細胞為EGFR陰性細胞;1b:EGFR轉染后EGFR的陽性率高達98.0%;1c:H1GFP細胞為EGFR陰性細胞

圖2 表皮生長因子(EGF)處理不同時間對H1EGFRwt和H1GFP細胞劃痕面積愈合的影響(×100) 給予EGF刺激時,相同時間內H1EGFRwt細胞的愈合程度明顯高于H1GFP細胞;不給予任何處理時,H1EGFRwt細胞和H1GFP細胞的愈合程度無顯著差異

流式細胞儀檢測結果顯示,H1細胞系為EGFR陰性細胞系(圖1a),轉染后H1細胞系的EGFR表達率高達98.0%(圖1b)。流式細胞儀分選后可得到純化的EGFR過表達的細胞系H1EGFRwt細胞。對照組H1GFP細胞根據GFP的綠色熒光,同樣用流式細胞儀對其進行分選,從而得到純化的H1GFP細胞,H1GFP細胞為EGFR陰性細胞系(圖1c)。

二、細胞劃痕實驗結果

結果顯示,給予實驗組H1EGFRwt細胞以及對照組H1GFP細胞EGF處理時,相同時間內H1EGFRwt細胞的愈合程度明顯高于H1GFP細胞;而兩組細胞不給予任何處理時,愈合程度無顯著差異(圖2)。為進一步確定實驗結果,分別計算兩組細胞不同時間點的劃痕面積愈合率,根據不同時間點的劃痕面積愈合率以及不同的處理因素繪制柱形圖(圖3)。結果顯示,給予EGF處理時,H1EGFRwt細胞的劃痕面積愈合率比對照組H1GFP細胞高,兩組劃痕愈合率數據滿足球形分布假設,差異有統計學意義(F=68.49,df=5,P＜0.05);不給予任何處理時,H1EGFRwt細胞與H1GFP細胞的劃痕面積愈合率數據不滿足球形分布假設,多變量方差分析差異無統計學意義(F=66.64,df=5,P＞0.05)。此外,由圖3還可發現,EGF刺激下在18 h和24 h時,H1EGFRwt細胞與對照組H1GFP細胞相比劃痕面積愈合率差異最顯著。

三、集落形成實驗結果

結果顯示,添加刃天青溶液前H1EGFRwt細胞的活細胞數評分為2018.7±116.2,而H1GFP細胞為2 069.7±95.0,兩組比較,t=1.32,df=9,P＞0.05。加入刃天青后,實驗組H1EGFRwt細胞的代謝評分為92 225.2±6 632.1,對照組H1GFP細胞為62 935.7±8 159.2,實驗組代謝評分顯著高于對照組(t=7.27,df=9,P＜0.01),表明 H1EGFRwt細胞與對照組相比有更高的集落形成能力和獨立生存能力。

四、Western印跡結果

H1EGFRwt細 胞 在 EGF刺 激 下 pPLCγ、pSTAT5、pSTAT3均被激活,而對照組H1GFP細胞以及不給予EGF處理時的兩組細胞均未被激活;pAkt和pMAPK在有無EGF刺激時各組細胞均可表達,但H1EGFRwt細胞給予EGF刺激時表達明顯增高。見圖4。

討 論

EGFR在人類腫瘤中常常呈現過表達狀態[3],而EGFR的過表達狀態與許多人類腫瘤的進展和治療效果不佳有關,已成為預后不良的標志物。Normanno等[6]證實,EGFR在鱗狀細胞癌中呈過表達狀態。Oh等[7]和Adamczyk等[8]分別發現宮頸癌和胰腺癌患者血清中EGFR的表達水平增高。而EGFR在黑素瘤中表達情況尚有爭議。一方面有研究證實,EGFR對于人葡萄膜黑素瘤細胞的增殖存活很重要,但與其表達水平關系不大[9];另一方面Hurks等[10]發現,EGFR在人葡萄膜黑素瘤中表達,且其表達與存活率之間呈負相關。此外Udart等[11]在晚期黑素瘤中檢測到了過表達的EGFR。我們的集落形成實驗顯示,EGFR過表達的H1EGFRwt細胞與對照組H1GFP細胞相比,H1EGFRwt細胞的獨立存活能力以及集落形成能力高于對照組細胞,說明EGFR過表達的H1EGFRwt細胞更容易存活。

圖3 表皮生長因子(EGF)處理不同時間對H1EGFRwt和H1GFP細胞劃痕面積愈合程度的影響 EGF處理時H1EGFRwt細胞的劃痕面積愈合率比H1GFP細胞高(F=68.49,df=5,P＜0.05);不給予任何處理時H1EGFRwt細胞與H1GFP細胞的劃痕面積愈合率差異無統計學意義(F =66.64,df=5,P＞0.05),而且EGF刺激下在18 h和24 h時H1EGFRwt細胞與對照組H1GFP細胞劃痕面積愈合率差異最顯著

圖4 表皮生長因子(EGF)處理后H1EGFRwt和H1GFP細胞的信號激活情況 1:經EGF處理的H1GFP細胞;2:經EGF處理的H1EGFRwt細胞;3:H1GFP細胞;4:H1EGFRwt細胞

腫瘤轉移是一個多因素多步驟的復雜過程,包括黏附、遷移和侵襲等方面的改變[12]。已有研究證實,EGFR過表達與多種腫瘤的生長和轉移機制有關[10],但目前對過表達的EGFR參與黑素瘤的發生發展及轉移的機制仍不清楚。有研究報道,在黑素瘤轉移瘤中可檢測到EGFR基因的高頻率表達[13]。Slominski等[14]發現,惡性黑素瘤中EGFR的表達增加與腫瘤侵襲和轉移的程度之間有相關性。Huang等[15]也發現,EGFR的過表達與人黑素瘤細胞系在裸小鼠實驗中的自發轉移有相關性。我們的研究發現,過表達的EGFR在EGF的刺激下顯著提高了細胞的遷移能力(圖2、3),此外,細胞獨立存活和集落形成能力的提高也有助于腫瘤細胞的轉移以及轉移瘤的存活發展。

EGFR所參與的信號轉導通路調控著細胞的增殖、分化和凋亡,對腫瘤的發展以及轉移有重要作用。Udart等[11]證實,EGFR活性隨黑素瘤的發生發展及轉移逐漸增強,說明EGFR信號通路與黑素瘤的發生、發展以及轉移相關。EGF可結合其受體,促進受體二聚化和自身磷酸化,從而導致各種下游信號分子如MAPK和PI3K/Akt信號激活[16],而MAPK和PI3K/Akt信號通路在腫瘤細胞侵襲和轉移的調控中起到關鍵性的作用[17]。除此之外,STAT3的激活在腫瘤的形成和發展過程中也起到重要作用[18]。研究表明,在黑素瘤腫瘤模型中靶向抑制STAT3可誘導腫瘤消退[19],抑制血管生成[20],預防腫瘤轉移[21],促進免疫應答的活化[22-23]。Wellbrock等[24]發現,STAT5過度表達可促進黑素瘤的發生發展,而Wellbrock等[25]在早期還發現,STAT5的激活在黑素細胞向黑素瘤的轉化過程中發揮重要作用。Jiang等[26]發現,如果抑制PI3K-Akt和PLCγ-PKC通路可誘導細胞凋亡,說明PI3K-Akt和PLCγ-PKC信號通路在維持細胞存活方面發揮了重要作用。在我們的研究中,H1EGFRwt細胞在EGF刺激下,pPLCγ、pSTAT5、pSTAT3均被激活,pAkt和 pMAPK在H1EGFRwt細胞給予EGF刺激時表達明顯高于其他對照組,說明EGFR過表達的情況下,EGF可以刺激EGFR激活或增強磷酸化信號Akt、STAT5、STAT3、PLCγ以及MAPK所參與的各條信號通路,而他們所參與的信號通路對腫瘤細胞侵襲、轉移、增殖和存活方面有促進作用,促進了腫瘤的發展和轉移。

綜上所述,我們的研究證明,EGFR過表達可以提高H1細胞系的獨立存活能力,在EGF的刺激下可提高H1細胞系的遷移能力以及激活下游信號pPLCγ、pSTAT5和 pSTAT3, 并且使 pAkt以及pMAPK表達顯著增強,從而促進了黑素瘤細胞轉移的發生。我們的研究可能為黑素瘤轉移的靶向治療提供了一定的理論依據,從而進一步支持EGFR有可能成為黑素瘤轉移治療的新靶點。

[1]Balch CM，Gershenwald JE，Soong SJ，et al.Update on the melanoma staging system:the importance of sentinel node staging and primary tumor mitotic rate[J].J Surg Oncol，2011，104(4):379-385.

[2]Guida M，Pisconti S，Colucci G.Metastatic melanoma:the new era of targeted therapy[J].Expert Opin Ther Targets，2012，16 Suppl 2:S61-S70.

[3]Boone B，Jacobs K，Ferdinande L，et al.EGFR in melanoma:clinical significance and potential therapeutic target[J].J Cutan Pathol，2011，38(6):492-502.

[4]Wang J，Daphu I，Pedersen PH，et al.A novel brain metastases model developed in immunodeficient rats closely mimics the growth of metastatic brain tumours in patients[J].Neuropathol Appl Neurobiol，2011，37(2):189-205.

[5]SongHW，KumarBK，KimSH，etal.Agmatineenhancesneurogenesis by increasing ERK1/2 expression，and suppresses astrogenesis by decreasing BMP 2，4 and SMAD 1，5，8 expression in subventricular zone neural stem cellsr[J].Life Sci，2011，89(13-14):439-449.

[6]Normanno N，De Luca A，Bianco C，et al.Epidermal growth factor receptor(EGFR)signaling in cancer[J].Gene，2006，366(1):2-16.

[7]Oh MJ，Choi JH，Kim IH，et al.Detection of epidermal growth factor receptor in the serum of patients with cervical carcinoma[J].Clin Cancer Res，2000，6(12):4760-4763.

[8]Adamczyk KA，Klein-Scory S，Tehrani MM，et al.Characterization of soluble and exosomal forms of the EGFR released from pancreatic cancer cells[J].Life Sci，2011，89(9-10):304-312.

[9]Wu X，Zhou J，Rogers AM，et al.c-Met，epidermal growth factor receptor，and insulin-like growth factor-1 receptor are important for growth in uveal melanoma and independently contribute to migration and metastatic potential[J].Melanoma Res，2012，22(2):123-132.

[10]Hurks HM，Metzelaar-Blok JA，Barthen ER，et al.Expression of epidermal growth factor receptor:risk factor in uveal melanoma[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41(8):2023-2027.

[11]Udart M，Utikal J，Kr?hn GM，et al.Chromosome 7 aneusomy.A marker for metastatic melanoma?Expression of the epidermal growth factor receptor gene and chromosome 7 aneusomy in nevi，primary malignant melanomas and metastases[J].Neoplasia，2001，3(3):245-254.

[12]Friedl P，Locker J，Sahai E，et al.Classifying collective cancer cell invasion[J].Nat Cell Biol，2012，14(8):777-783.

[13]Koprowski H，Herlyn M，Balaban G，et al.Expression of the receptor for epidermal growth factor correlates with increased dosage of chromosome 7 in malignant melanoma[J].Somat Cell Mol Genet，1985，11(3):297-302.

[14]Slominski A，Ross J，Mihm MC.Cutaneous melanoma:pathology，relevant prognostic indicators and progression[J].Br Med Bull，1995，51(3):548-569.

[15]Huang TS，Rauth S，Das Gupta TK.Overexpression of EGF receptor is associated with spontaneous metastases of a human melanoma cell line in nude mice[J].Anticancer Res，1996，16(6B):3557-3563.

[16]Martín-Orozco RM，Almaraz-Pro C，Rodríguez-Ubreva FJ，et al.EGF prevents the neuroendocrine differentiation of LNCaP cells induced by serum deprivation:the modulator role of PI3K/Akt[J].Neoplasia，2007，9(8):614-624.

[17]Kulawiec M，Owens KM，Singh KK.Cancer cell mitochondria confer apoptosis resistance and promote metastasis[J].Cancer Biol Ther，2009，8(14):1378-1385.

[18]Bowman T，Garcia R，Turkson J，et al.STATs in oncogenesis[J].Oncogene，2000，19(21):2474-2488.

[19]Niu G，Heller R，Catlett-Falcone R，et al.Gene therapy with dominant-negative Stat3 suppresses growth ofthe murine melanoma B16 tumorin vivo[J].Cancer Res，1999，59(20):5059-5063.

[20]Niu G，Wright KL，Huang M，et al.Constitutive Stat3 activity upregulates VEGF expression and tumor angiogenesis[J].Oncogene，2002，21(13):2000-2008.

[21]Xie TX，Wei D，Liu M，et al.Stat3 activation regulates the expression of matrix metalloproteinase-2 and tumor invasion and metastasis[J].Oncogene，2004，23(20):3550-3560.

[22]Wang T，Niu G，Kortylewski M，et al.Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells[J].Nat Med，2004，10(1):48-54.

[23]Kortylewski M，Jove R，Yu H.Targeting STAT3 affects melanoma on multiple fronts[J].Cancer Metastasis Rev，2005，24(2):315-327.

[24]Wellbrock C，Weisser C，Hassel JC，et al.STAT5 contributes to interferon resistance of melanoma cells[J].Curr Biol，2005，15(18):1629-1639.

[25]Wellbrock C，Geissinger E，Gómez A，et al.Signalling by the oncogenic receptor tyrosine kinase Xmrk leads to activation of STAT5 in Xiphophorus melanoma[J].Oncogene，1998，16(23):3047-3056.

[26]Jiang YY，Huang H，Wang HJ，et al.Interruption of mitochondrial complex IV activity and cytochrome c expression activated O2·--mediated cell survival in silibinin-treated human melanoma A375-S2 cells via IGF-1R-PI3K-Akt and IGF-1R-PLC γ-PKC pathways[J].Eur J Pharmacol，2011，668(1-2):78-87.

2014-05-02)

(本文編輯:顏艷)

Effect of overexpression of epidermal growth factor receptor on the growth and migration of a brainmetastatic H1 human melanoma cell line

Kang Jing*，Hrvoje Miletic，Guo Shulan.*Shandong University School of Medicine，Jinan 250012，China

Guo Shulan，Email:guoshulan@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the role of epidermal growth factor receptor(EGFR)in the growth and migration of melanoma.MethodsA brain-metastatic human melanoma cell line H1，which had been developed in our laboratory，was used in this study.Some H1 melanoma cells were stably transfected with wild-type EGFR via lentiviral vectors to overexpress EGFR(H1EGFRwt)，and some H1 cells transfected with green fluorescent protein(GFP)served as the control group(H1GFP).After transfection，the cells were sorted and purified.Then，scratch wound healing assay was performed to estimate the migratory activity of H1 cells;colony-forming assay was conducted to investigate the effects of EGFR on the survival ability and colony-forming ability of H1 cells，and resazurin reduction test was used to evaluate colony formation results;Western blot was carried out to measure the expressions of signaling pathways activated by EGFR.Statistical analysis was done by repeated measures analysis of variance(ANOVA)for the comparison of wound-area healing rate，and by pairedttest for the comparison of metabolic activity，between the two groups of H1 cells by using SPSS software version 20.0.ResultsFlow cytometry showed that H1 cells were successfully transfected with EGFR and GFP respectively，and purified H1EGFRwt and H1GFP cells were obtained after cell sorting.The wound-area healing rate at 6，18，24 and 48 hours after epidermal growth factor(EGF)stimulation was 0.145±0.066，0.479±0.096，0.571±0.198 and 0.672±0.199 respectively for H1EGFRwt cells，0.051± 0.036，0.254± 0.038，0.303± 0.077 and 0.498 ± 0.111 respectively for H1GFP cells.The degree of wound healing in H1EGFRwt cells was significantly higher than that in H1GFP cells(F=68.49，df=5，P＜0.05).Colony-forming assay revealed that the average metabolic activity score of H1EGFRwt cells was significantly higher than that of H1GFP cells(92 225.2 ± 6 632.1 vs.62 935.7 ± 8 159.2，t=2.26，df=9，P＜0.01).Western blot showed that EGF might induce the phosphorylation of downstream signaling proteins such as phosphatidylinositol-specific phospholipase C-γ (PLCγ)，signal transducer and activator of transcription 5(STAT5)and 3(STAT3)in H1EGFRwt cells，but not in H1GFP cells.In addition，the expressions of phosphorylated serine/threonine protein kinase(pAKT)and mitogen-activated protein kinase(pMAPK)were significantly higher in H1EGFRwt cells than in H1GFP cells after EGF stimulation.Conclusions EGFR may play an important role in the metastasis of H1 melanoma cells，and might serve as a target in the treatment of metastatic melanoma.

Melanoma;Receptor，epidermal growth factor;Epidermal growth factor

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.013

250012濟南,山東大學醫學院(康晶);挪威卑爾根大學生物醫學系(Hrvoje Miletic);山東大學齊魯醫院皮膚科(郭淑蘭)

郭淑蘭,Email:guoshulan@medmail.com.cn