尋常性銀屑病患者外周血Th22細胞及其白細胞介素22的表達

陳永鋒 辛甜甜 王曉華 陳文靜 蔡碧珊 薛耀華

尋常性銀屑病患者外周血Th22細胞及其白細胞介素22的表達

陳永鋒 辛甜甜 王曉華 陳文靜 蔡碧珊 薛耀華

目的探討尋常性銀屑病患者外周血Th22細胞及相關因子白細胞介素22(IL-22)表達水平與疾病嚴重程度及病程的相關性。方法抽取40例尋常性銀屑病患者和30例健康對照者外周血,流式細胞儀檢測外周血Th22細胞比例,ELISA法檢測血清中IL-22的表達。采用t檢驗、Pearson相關分析法進行分析。結果尋常性銀屑病患者外周血Th22細胞百分比(0.65%±0.48%)高于健康對照組(0.33%±0.15%),兩組差異有統計學意義(t=3.89,P＜0.01);銀屑病患者Th22細胞與銀屑病病情嚴重度評分(PASI)呈正相關(r=0.38,P＜0.05),但與病程無相關性(r=0.20,P＞0.05)。銀屑病患者血清中IL-22表達水平[(67.96±14.32)ng/L]高于健康對照組[(40.59±9.91)ng/L],兩組差異有統計學意義(t=9.45,P＜0.01);銀屑病患者血清IL-22表達水平與PASI呈正相關(r=0.94,P＜0.01),與病程無相關性(r=0.10,P＞0.05)。結論Th22細胞及IL-22在尋常性銀屑病外周血中有高表達,且Th22細胞及IL-22水平均與疾病嚴重程度相關。

銀屑病;CD4+T細胞;Th22細胞;白細胞介素22

Th22是近年來發現的一種不同于Th1、Th2及Th17的新型CD4+T細胞,特征性地表達CCR6、CCR4和CCR10,分泌白細胞介素22(IL-22)、腫瘤壞死因子 α(TNF-α),而不產生 IL-4、IL-17和干擾素γ(IFN-γ)[1-3]。Th22具有獨立的分化和發育調節機制,在自身免疫性疾病、感染性疾病以及組織修復中發揮重要調節作用。我們用流式細胞儀檢測銀屑病患者外周血Th22細胞的表達,并用ELISA檢測血清中IL-22的水平,探討Th22細胞及相關因子IL-22與銀屑病的相關性。

病例與方法

一、臨床資料

入選病例為2011年8月至2012年5月在廣東省皮膚病醫院門診及住院部確診的尋常性斑塊狀銀屑病(以下簡稱銀屑病)患者40例,其中男24例,女16例,年齡21～63歲,平均(36.63±9.28)歲;病程4個月至10年,平均(2.67±2.37)年;銀屑病病情嚴重度評分(PASI)[4]5.7～26.2,平均12.44±4.85。所選病例均符合《臨床皮膚病學》第3版[5]診斷標準,所有患者近3個月內未系統使用糖皮質激素及免疫抑制劑,1個月內未外用糖皮質激素或其他制劑或接受紫外線照射等治療,無合并先天或獲得性自身免疫性疾病及其他免疫相關性或炎癥性、真菌感染疾病。對照組為健康體檢者30例,其中男17例,女13例,年齡23～53歲,平均年齡(35.30±8.43)歲;觀察前1個月內無細菌、真菌、病毒感染,既往無銀屑病等免疫相關皮膚疾病。患者組及健康對照組的性別及年齡差異無統計學意義(P＞0.05)。本研究通過廣東省皮膚病醫院倫理委員會批準,患者簽署知情同意書。

二、試劑和儀器

美國eBioscience公司生產的藻多甲素-葉綠素蛋白5.5(PerCP-Cy5.5) 抗人CD3、Alexa Fluor 488抗人CD8、藻紅蛋白(PE)抗人IL-22、別藻藍蛋白(APC) 抗人 IL-17、PE-Cy7 抗人 IFN-γ、PE 、APC、PE-Cy7鼠IgG1 K同型對照。美國Sigma公司生產的佛波酯肉豆蔻酸乙酸鹽(PMA)、離子霉素、蛋白轉運抑制劑(BFA)。聯科生物科技有限公司生產的IL-22 ELISA試劑盒、FIX&PERM。美國BD公司生產的FACS CantoⅡ型流式細胞儀。

三、方法

1.外周血Th22細胞的流式細胞儀計數:采集受檢者靜脈血2 ml,肝素鈉抗凝,24 h內檢測。取試管1支,加入RPMI 1640細胞培養液和抗凝血各150 μl,再加入 50 mg/L 離子霉素工作液 6 μl、1 mg/L PMA 工作液 7.5 μl、0.5 g/L BFA 工作液 6 μl,混勻,置37℃、5%CO2培養箱內培養5 h,然后取出混勻;取2支試管,A管為實驗管,B管為同型管,各加入上述混勻液100 μl,再加入PE-Cy5-CD3和FITC-CD8各5 μl,室溫避光孵育15 min;然后兩管分別加入Fix&Perm中的Reagent A(即固定劑)100 μl,室溫避光孵育15 min;加入磷酸鹽緩沖液(PBS)3 ml,400×g離心5 min,棄上清,再加入FIX&Perm中的Reagent B(即破膜劑和溶血劑)100 μl,靜置3 min;然后A管中加入PE-Cy7-IFN-γ、APCIL-17、PE-IL-22 各 5 μl,B 管中加入 PE-Cy7-IgG1、APC-IgG1、PE-IgG1 各 5 μl,室溫避光孵育 30 min;然后兩管均加入PBS 3 ml,400×g離心5 min,棄上清,用PBS 400 μl重懸細胞,上機檢測。以FSC/SSC設門,收集20 000個淋巴細胞,圈定淋巴細胞析,檢測結果以±s表示,采用成組t檢驗分別比較兩組外周血Th22細胞比例和血清IL-22水平差異,采用Pearson相關分析法進行相關性分析,P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、外周血Th22細胞比例及血清IL-22表達水平

銀屑病患者組外周血Th22細胞比例(0.65%±0.48%)高于健康對照組(0.33%±0.15%),兩組比較差異有統計學意義(t=3.89,P＜0.01),見圖1。銀屑病患者組血清IL-22表達水平[(67.96±14.32)ng/L]高于健康對照組[(40.59±9.91)ng/L],兩組比較差異有統計學意義(t=9.45,P＜0.01)。

二、相關性分析結果

銀屑病患者外周血Th22細胞比例及血清IL-22水平與PASI評分(12.44±4.85)均呈顯著正相關(r值分別為0.38和0.94,P＜0.05和 ＜0.01),而與患者病程(2.67±2.37年)均無顯著相關性(r值分別為0.20和0.10,均P＞0.05)。

討 論

Th22細胞是近幾年發現的新型CD4+記憶性T細胞亞群[1-3]。越來越多的證據表明,Th22細胞在自身免疫性疾病、炎癥性疾病以及組織修復中發揮重要作用[8-10]。目前發現此細胞參與銀屑病發病主要是通過分泌IL-22等炎癥因子作用于角質形成細胞起作用,包括促進角質形成細胞過度增殖,抑制角質形成細胞的正常分化以及分泌及誘導相關因子群為R1,在R1門內以CD3+/SSC設門,圈定T淋巴細胞為R2,在R2門內以CD3/CD8表達的散點圖中,圈定CD3+/CD8-的T淋巴細胞為R3,在R3門內收集表達CD8-/IL-22+的細胞,即為CD3+CD4+IL-22+細胞群(通常以佛波酯、離子霉素刺激后CD4的表達會降低,以熒光觀測CD3+CD4+IL-22+比較困難,而CD8刺激后表達降低不明顯,因此用CD3+CD8-/IL-22+來代表CD3+CD4+/IL-22+細胞[6-7]);再分別以IL-17和IFN-γ設門,得到CD3+CD8-IL-22+IL-17-IFN-γ-的T淋巴細胞群即為Th22細胞,以熒光抗體染色陽性細胞的百分率記錄結果。

2.血清中IL-22的檢測:采集受檢者靜脈血3 ml,靜置留取血清500 μl,置-20℃保存待檢。嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測,用ELISA軟件繪制標準曲線并計算其濃度。

3.統計學分析:用SPSS17.0軟件進行統計分參與炎癥反應,從而引發銀屑病特征性皮損[11-15]。

圖1 銀屑病患者與健康對照組外周血Th22細胞流式細胞儀分析散點圖 銀屑病患者組血清IL-22的表達水平高于健康對照組,Th22細胞比例高于健康對照組 上圖為銀屑病患者組,下圖為健康對照組

我們采用流式細胞儀檢測銀屑病患者和健康對照者外周血CD4+T細胞中Th22細胞比例,檢測發現,銀屑病患者外周血Th22細胞較健康對照組高(圖1),提示Th22細胞參與銀屑病發病,與目前國外研究結果一致[3，10，16]。 雖然研究認為Th22主要定位于皮損[10],外周血較少,但與健康對照組相比差異仍有統計學意義。此外,將Th22細胞及其相關因子IL-22表達水平與PASI評分、病程作相關性分析發現,Th22細胞、IL-22均與PASI評分成正相關,提示Th22細胞、IL-22可反映疾病的嚴重程度,或許在后續治療中可通過監測Th22細胞及IL-22水平的變化來評價療效。而Th22細胞、IL-22水平均與病程無相關性,可能是由于Th22及IL-22主要參與銀屑病皮損形成及發展,當疾病緩解皮疹消退時,Th22細胞或IL-22水平即降低[17],而并非隨病程遷延而長期存在,但具體機制還有待于進一步研究。

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2014-03-24)

(本文編輯:周良佳 顏艷)

Frequency of T helper type 22 cells and expression of interleukin-22 in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris

Chen Yongfeng*，Xin Tiantian，Wang Xiaohua，Chen Wenjing，Cai Bishan，Xue Yaohua.*Guangdong Provincial Dermatology Hospital，Guangzhou 510091，China

Chen Yongfeng，Email:gdcyf@163.com

ObjectiveTo determine the frequency of T helper type 22(Th22)cells and expression level of interleukin-22(IL-22)in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris，and to investigate their relationship with disease severity and clinical course.MethodsPeripheral blood samples were obtained from 40 patients with psoriasis vulgaris and 30 healthy human controls.Five-color flow cytometry was performed to determine the percentage of Th22 cells in peripheral blood，and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to measure the expression of serum IL-22.Statistical analysis was carried out byttest and Pearson correlation analysis.ResultsBoth the percentage of Th22 cells and serum level of IL-22 in peripheral blood were significantly higher in patients with psoriasis vulgaris than in healthy human controls(Th22 cells:0.65% ±0.48%vs.0.33% ±0.15%，t=3.89，P＜0.01;IL-22:(67.96 ± 14.32)vs.(40.59 ± 9.91)ng/L，t=9.45，P＜ 0.01).Further more，Th22 cell percentage and IL-22 serum level in peripheral blood were both positively correlated with psoriasis area and severity index(PASI)in these patients(r=0.38，0.94，P＜ 0.05 and 0.01，respectively)，but neither of them correlated with clinical course of psoriasis vulgaris(r=0.20，0.10，respectively，bothP＞ 0.05).Conclusions The percentage of Th22 cells and level of IL-22 are increased in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris，and both of them are correlated with disease severity.

Psoriasis;CD4-positive T-lymphocytes;Th22 cells;Interleukin-22

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.005

廣東省2010年第一批產業技術研究與開發資金計劃項目(2010B031600115)

510091廣州,廣東省皮膚病醫院(陳永鋒、王曉華、陳文靜、蔡碧珊、薛耀華);廣州醫科大學附屬第三醫院皮膚科(辛甜甜)

陳永鋒,Email:gdcyf@163.com