Nutlin-3對人A375黑素瘤細胞生物學行為的影響及可能機制

丁小杰 魏大鵬 陳菊萍

Nutlin-3對人A375黑素瘤細胞生物學行為的影響及可能機制

丁小杰 魏大鵬 陳菊萍

目的觀察順式咪唑啉衍生物nutlin-3對人A375黑素瘤細胞生物學行為的影響,研究其機制。方法將A375細胞分為實驗組和對照組,實驗組細胞接受2.5、5、10 μmol/L nutlin-3處理,對照組細胞采用二甲基亞砜處理。分別于作用24、48、72 h后,噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖情況;Western印跡檢測p53蛋白表達的改變;流式細胞儀檢測細胞周期分布以及細胞凋亡;Transwell法檢測遷移性變化。采用重復測量的方差分析進行統計學檢驗。結果2.5、5、10 μmol/L nutlin-3處理A375細胞24、48、72 h后,MTT法顯示不同時間點間的增殖抑制率差異有統計學意義(F=67.43,P＜0.01),不同濃度間的抑制率差異有統計學意義(F=135.58,P＜0.01),濃度越高抑制率越高;時間和濃度之間有交互作用(F=26.95,P＜0.01)。Western印跡、流式細胞儀、Transwell法檢測顯示,不同時間點之間A375細胞的p53表達、G2期細胞百分率、凋亡率、遷移抑制率差異均有統計學意義(F值分別為1255.00、831.38、809.45、1100.00,均P＜0.01),除p53外,時間越長各項指標值越高;不同濃度間各項指標值差異均有統計學意義(F值分別為9196.00、267.99、723.83、1667.00,均P＜0.01),濃度越高各項指標值越高;時間與濃度之間交互作用有統計學意義(F值分別為826.79、21.602、44.48、313.09,均P＜0.01)。結論Nutlin-3可能通過p53蛋白積累途徑抑制人A375細胞的增殖和遷移,促進細胞周期停滯和細胞凋亡。

nutlin-3;黑色素瘤,實驗性;細胞周期;細胞凋亡;細胞運動

抑癌基因p53在保護遺傳穩定性中起關鍵的作用。由紫外線引起的p53突變在黑素瘤中很罕見,只是其表達處于低水平,這是因為雙微體基因-2(double minute 2,嚙齒類為MDM2,人類為HDM2)編碼的產物與p53蛋白結合[1],促進p53蛋白降解。Nutlin-3是眾多MDM2抑制劑中的一類,Vassilev等[2]發現,在野生型p53腫瘤細胞中,nutlin-3重建p53通路,誘導細胞周期停滯,促進細胞凋亡。本實驗使用MDM2抑制劑nutlin-3作為誘導p53積累的藥理學工具,初步探討其對人A375細胞生物學行為的影響。

材料和方法

一、材料

永生化人黑素瘤細胞株A375細胞系產自中國科學院上海細胞生物學研究所,nutlin-3產自美國Sigma公司。二甲基亞砜(DMSO)產自生工生物工程(上海)股份有限公司,p53抗體(一抗)產自美國CST公司,辣根過氧化物酶標記的二抗產自生工生物工程(上海)股份有限公司,2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)試劑盒產自南京凱基生物有限公司,硝酸纖維素膜(NC膜)產自美國Millipore公司,噻唑藍(MTT)產自美國Sigma公司,碘化丙錠(PI)細胞周期檢測試劑盒(KGA512)和膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測試劑盒產自南京凱基生物科技有限公司,細胞外基質(ECM)產自美國Sigma公司。12孔板Transwell小室產自美國Corning公司,倒置相差顯微鏡(CKX41-32PH)產自日本Olympus公司,ZS-3型酶聯免疫檢測儀產自北京市新風機電技術公司,流式細胞儀產自美國Beckman公司。

二、方法

1.細胞培養:A375細胞于37℃、5%CO2條件下培養于含10%(v/v)胎牛血清的1640培養基中。傳代計數以105個/ml的密度均勻接種于培養皿和6孔板中繼續培養,將生長良好處于對數生長期的細胞用于實驗。

2.試劑配制:Nutlin-3用DMSO配制成2.5、5、10 μmol/L 濃度。

3.實驗分組及處理:將A375細胞分為實驗組和對照組,實驗組細胞接受不同濃度nutlin-3(2.5、5、10 μmol/L)處理,對照組細胞采用DMSO處理。

4.MTT法檢測nutlin-3對A375細胞增殖的影響:分組處理后A375細胞在37℃、5%CO2培養箱中分別培養 24、48、72 h 后,每孔加入 5 g/L MTT 10 μl,再孵育 4 h。 去上清,加入 DMSO 200 μl/孔,在 ZS-3酶標儀上測定每孔吸光度(A)。腫瘤細胞增殖抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

5.Western印跡檢測p53蛋白的表達:不同濃度 nutlin-3(2.5、5、10 μmol/L)作用 A375 細胞 24、48、72 h后,分別用0.25%胰蛋白酶消化,14 000×g4℃離心5 min,PBS洗3次,加入適當體積的細胞裂解液。樣品在10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳,結束后將蛋白轉移至NC膜上,用含5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(PBS)封閉1 h,加入一抗(p53抗體),4℃過夜,PBS洗3次,加入辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫1 h,X線膠片顯影,掃描,Image J軟件分析圖片條帶,得出蛋白條帶峰面積值。

6.碘化丙錠(PI)染色流式細胞儀檢測A375細胞周期分布:分別于藥物作用24、48、72 h后,吸出上清培養液,胰酶消化,收集細胞,1 000 r/min(離心半徑12 cm)離心5 min,PBS洗2次,70%冰乙醇過夜。離心,棄上清,PBS洗2次,移至流式管中,加入100 μl RNaseA 37 ℃水浴 30 min;再加入 400 μl PI染色混勻,4℃避光30 min,流式細胞儀上樣,在488 nm激發波長下測定細胞DNA的含量,并用Multicyde分析軟件進行分析,得出處于G0/G1、S和G2/M各期的細胞比例。

7.Annexin V-FITC染色流式細胞儀檢測A375細胞凋亡:分別于藥物作用24、48、72 h后,吸出上清培養液,胰酶消化,收集細胞,制備成單細胞懸液,重懸于500 μl結合緩沖液,加入5μl Annexin VFITC,混勻后,加入5 μl PI,室溫避光反應5～15 min,上機檢測。

8.Transwell法檢測A375細胞的侵襲遷移:調節A375細胞密度為4×105個/ml,用含1%牛血清白蛋白(BSA)的無血清RPMI 1640重懸細胞,加入Transwell上室中,實驗組加入不同濃度nutlin-3(2.5、5、10 μmol/L),對照組加入相同體積 DMSO,Transwell下室加入含10%小牛血清的RPMI 1640,分別培養24、48、72 h后加 2%多聚甲醛固定細胞5 min,結晶紫溶液染色20 min,用PBS洗Transwell小室3次,倒置相差顯微鏡(400倍)下觀察和拍照,加入脫色液,于ZS-3型板式酶標儀570 nm波長處檢測A值。遷移抑制率 =(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

三、統計學分析

采用SPSS11.0軟件處理數據,進行重復測量的方差分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、Nutlin-3對A375細胞增殖的影響

不同濃度 nutlin-3(2.5、5、10 μmol/L)能夠抑制A375細胞的增殖,如圖1所示,2.5、5、10 μmol/L nutlin-3 作用 24 h后,增殖抑制率(n=3)分別為(7.106±2.709)%、(13.417 ± 2.383)% 、(18.078 ±3.062)%;48 h的抑制率分別為(23.560±1.554)%、(39.786 ± 7.076)%、(53.548 ±3.600)%;72 h的抑制率分別為(21.971±6.586)%、(48.317 ± 10.421)%、(71.856 ±2.188)%。不同時間點之間的增殖抑制率差別有統計學意義(F=67.43,P＜0.01),48 h時抑制率最大,與24 h抑制率差別有統計學意義,而與72 h的抑制率差別無統計學意義;不同濃度間的抑制率差別有統計學意義(F=135.58,P＜0.01),濃度越高抑制率越高;時間和濃度之間有交互作用(F=26.95,P＜0.01)。

二、Nutlin-3對A375細胞p53蛋白表達的影響

不同濃度 nutlin-3(2.5、5、10 μmol/L)處理 A375細胞后,細胞內p53被激活,表達增多。如表1所示,不同時間點p53表達差異有統計學意義(F=1255.00,P＜0.01),不同時間表達不同;不同濃度間的p53表達差異有統計學意義(F=9196,P＜0.01),濃度越高,p53表達越高。時間與濃度之間交互作用有統計學意義(F=826.79,P＜0.01)。見圖2。

三、Nutlin-3對A375細胞周期分布的影響

圖1 Nutlin-3對A375細胞增殖的抑制率

Nutlin-3作用于 A375 細胞 24、48、72 h 后,與對照組比較,不同濃度 nutlin-3(2.5、5、10 μmol/L)對A375細胞的細胞周期具有阻滯作用。如表1所示,不同時間點A375細胞G2期分布差異有統計學意義(F=831.38,P＜0.01),時間越長G2期細胞比例越高。不同濃度間A375細胞G2期分布差異有統計學意義(F=267.99,P＜0.01),濃度越高A375細胞G2期比例越高。時間與濃度之間交互作用有統計學意義(F=21.60,P＜0.01)。圖3為nutlin-3作用48 h后人A375黑素瘤細胞周期G2期的分布。

表1 Nutlin-3對A375細胞p53表達、G2期比例及A375細胞凋亡的影響(±s)

表1 Nutlin-3對A375細胞p53表達、G2期比例及A375細胞凋亡的影響(±s)

注:n=3。 a:用二甲基亞砜處理A375細胞

組別 p53 G2期(%) 凋亡(%)對照組a 24 h 1 979.000±111.517 9.310±7.550 2.267±0.153 48 h 3 058.333±52.786 15.667±0.586 4.967±0.153 72 h 4 321.333±72.748 20.167±0.874 8.833±0.208 2.5 μmol/L nutlin-3 24 h 5 685.333±193.480 11.800±0.624 5.000±3.000 48 h 8 053.000±131.936 22.133±0.503 8.233±0.153 72 h 4 729.667±42.147 26.333±0.737 14.567±0.551 5 μmol/L nutlin-3 24 h 8 178.667±441.151 15.367±1.137 7.867±0.252 48 h 13 285.000±132.510 27.633±3.444 12.367±0.306 72 h 11 656.670±188.235 36.567±0.611 19.300±0.529 10 μmol/L nutlin-3 24 h 19 381.000±307.161 22.767±0.569 10.067±0.208 48 h 19 470.330±179.350 38.400±0.700 18.267±0.289 72 h 27 183.000±133.974 40.767±0.513 29.567±2.203

四、Nutlin-3對A375細胞凋亡的影響

圖2 Nutlin-3對人A375黑素瘤細胞p53蛋白表達的影響1:DMSO;2:2.5 μmol/L;3:5 μmol/L;4:10 μmol/L

圖3 Nutlin-3作用48 h,人A375黑素瘤細胞G2期的分布

Nutlin-3作用于 A375細胞 24、48、72 h后,與對照組比較,不同濃度 nutlin-3(2.5、5、10 μmol/L)增加A375細胞的凋亡比率。如表1所示,不同時間點A375細胞凋亡率差異有統計學意義(F=809.45,P＜0.01),時間越長A375細胞凋亡率越高;不同濃度間的A375細胞凋亡率差異有統計學意義(F=723.83,P＜0.01),濃度越高A375細胞凋亡率越高。時間與濃度之間交互作用有統計學意義(F=44.48,P＜0.01)。圖4為nutlin-3作用72 h后人A375黑素瘤細胞凋亡比率。

圖4 Nutlin-3作用72 h,人A375黑素瘤細胞凋亡比率

五、Nutlin-3對A375細胞遷移的影響

如圖 5 所示,2.5、5、10 μmol/L nutlin-3 作用 24 h后,遷移抑制率(n=3)分別為(10.501±2.902)%、(11.422±7.893)%、(22.557±1.497)%;48 h的抑制率分別為(20.940±2.613)%、(36.177±5.062)%、(42.704±1.453)%;72 h的抑制率分別為(36.457± 2.600)%、(38.886± 6.116)%、(48.434±0.655)%。不同時間點之間A375遷移抑制率差異有統計學意義(F=1 100.00,P＜0.01),時間越長遷移抑制率越高;不同濃度間遷移抑制率差異有統計學意義(F=1 667.00,P＜0.01),濃度越高遷移抑制率越高。時間與濃度之間交互作用有統計學意義(F=313.09,P＜0.01)。Nutlin-3能夠顯著地抑制A375細胞的遷移。

討 論

圖5 Nutlin-3對A375細胞遷移的抑制率

抑癌基因p53在黑素瘤的發生中起到了重要的作用,在黑素瘤早期p53極少發生突變,隨著其進展,該基因突變率越來越高[3]。在黑素瘤中p53表達處于低水平,這是因為雙微體基因編碼的產物與p53蛋白結合,MDM2是p53基因誘導產生的,并形成了自動負調節循環,將p53轉運出細胞核,并通過泛素化促進p53的降解[4]。對p53和MDM2復合物的晶體結構的研究揭示,小分子抑制劑可以與MDM2競爭性結合p53位點,以此達到升高p53的目的。

Nutlin-3是眾多MDM2抑制劑中的一類,能特異性與p53分子中3個疏水性氨基酸Leu26、Trp23、Phe19結合,而該位點就是與 MDM2的Try100相互作用的直接接觸點,具有高效的親和性、專一性以及細胞可滲透性。Nutlin-3與p53結合后,抑制MDM2與p53的結合,使p53積聚,從而引起一系列p53介導的抗腫瘤作用:細胞周期停滯和細胞凋亡。近來,Vassilev等[2]發現,在野生型p53的HCT116結腸癌細胞、RKO結腸癌細胞和SJSA-1骨肉瘤細胞中,nutlin-3在體內外均能抑制MDM2-p53結合,促進p53通路重建,從而激活p21,使腫瘤的細胞周期停滯,激活bax基因促進腫瘤細胞凋亡并抑制腫瘤生長。在其他一些表達野生型p53的腫瘤細胞(如視網膜母細胞瘤[5]、神經纖維瘤[6]、橫紋肌細胞癌[7]等)中nutlin-3也表現出同樣的作用。Nutlin-3可以誘導瘤細胞和正常細胞的細胞周期停滯,但卻只引起腫瘤細胞的凋亡[8-9]。在與其他化療藥物聯合作用于肺癌細胞時,nutlin-3可以通過激活p53引起細胞周期停滯,從而減輕紫杉醇對正常細胞的毒性作用[10]。有研究[11]發現,nutlin-3可以減少表達野生型p53人HT1080鼻咽癌細胞、人U2OS骨肉瘤細胞、人SAOS成骨肉瘤細胞和人A549肺癌細胞的肌動蛋白纖維和黏著斑的大小和數量,引起細胞骨架重構,抑制細胞的遷徙和侵襲能力。

本實驗首先采用MTT法檢測不同濃度nutlin-3作用不同時間對A375細胞增殖抑制率,發現nutlin-3對A375細胞的增殖抑制作用具有濃度依賴性和時間依賴性。進一步用PI染色流式細胞儀檢測nutlin-3對細胞周期分布的影響,結果顯示,nutlin-3通過p53的積累,使A375細胞G2期比例增多,引起細胞周期停滯。正常情況下對于不能修復的DNA損傷,p53將啟動激活一系列下游轉錄信號,促進細胞凋亡。因此,我們進一步檢測nutlin-3對A375細胞凋亡的影響,結果顯示,nutlin-3促進A375細胞凋亡。構建Transwell小室是為了進一步驗證nutlin-3對A375細胞侵襲性的影響,結果顯示,nutlin-3能抑制A375細胞的侵襲遷移。

基于上述實驗研究,我們發現,nutlin-3通過積累p53蛋白,引起A375細胞周期G2期停滯,促進細胞凋亡,從而抑制A375細胞的增殖,并抑制A375細胞的侵襲遷移能力。在A375細胞荷瘤鼠動物模型中nutlin-3是否具有相同的抗腫瘤效應?Nutlin-3誘導的細胞凋亡途徑具體是哪條?Nutlin-3治療腫瘤會不會導致p53的突變或其他p53通路的缺損?除了p53通路,nutlin-3是否還有別的通路?Nutlin-3能否單一或聯合使用來治療p53變異的腫瘤?這些問題都有待于進一步研究。

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2014-04-19)

(本文編輯:尚淑賢)

Effect of nutlin-3 on the biological behavior of A375 human melanoma cells and its mechanism

Ding Xiaojie，Wei Dapeng，Chen Juping*.*Department of Dermatology，Second Clinical Medical College of Yangzhou University，Yangzhou 225001，China

Chen Juping，Email:chenjuping@medmail.com.cn

ObjectiveTo estimate the effect of a cis-imidazoline derivative，nutlin-3，on the biological behavior of A375 human melanoma cells，and to investigate its mechanism.MethodsCultured A375 cells were divided into several test groups treated with nutlin-3 at different concentrations(2.5，5，10 μmol/L)for 24，48 and 72 hours，and a control group treated with dimethyl sulfoxide(DMSO)only.Then，methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was performed to evaluate cellular proliferative activity，Western blot to measure the expression of p53 protein，flow cytometry to estimate cell cycle phase distribution and apoptosis rate，and Transwell assay to evaluate migratory activity，of A375 cells.Statistical analysis was carried out by repeated-measures analysis of variance(ANOVA).ResultsAfter treatment with nutlin-3 of 2.5，5 and 10 μmol/L for 24，48 and 72 hours，significant differences were observed among different time points at each concentration and among different concentrations at the same time point in proliferation inhibition rate(F=67.43，135.58，respectively，bothP＜ 0.01) ，p53 protein expression level(F=1255.00，9196.00，respectively，bothP＜ 0.01)，percentage of cells at G2 phase(F=831.38，267.99，respectively，bothP＜ 0.01)，apoptosis rate(F=809.45，723.83，respectively，bothP＜ 0.01)，migration inhibition rate(F=1100.00，1667.00，respectively，bothP＜ 0.01).The influence of nutlin-3 on cellular proliferative activity increased with the increase in its concentration，and that on percentage of cells at G2 phase，apoptosis rate and migratory activity increased with the increase in its concentration and treatment duration.There was a significant interaction between the treatment duration and concentration of nutlin-3 for p53 protein expression level in(F=826.79，P＜ 0.01)，percentage of cells at G2 phase in(F=21.602，P＜ 0.01)，apoptosis rate in(F=44.48，P＜ 0.01)，migratory activity of(F=313.09，P＜ 0.01)，and cellular proliferative activity of(F=26.95，P＜0.01)，A375 cells.ConclusionNutlin-3 may inhibit the proliferation and migration of，but promote cell cycle arrest and apoptosis in，A375 cells，through accumulation of p53 protein.

Nutlin-3;Melanoma，experimental;Cell cycle;Apoptosis;Cell movement

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.011

225001揚州大學第二臨床醫學院皮膚科[丁小杰(現在南京中醫藥大學附屬第二醫院、江蘇省第二中醫院皮膚科,210017)、陳菊萍];四川大學基礎與法醫學院免疫教研室(魏大鵬)

陳菊萍,Email:chenjuping@medmail.com.cn