夫西地酸乳膏對(duì)小鼠急性皮膚屏障損傷引起炎癥反應(yīng)的抑制作用

仲少敏 郭建美 陶榮 孫楠 吳艷

夫西地酸乳膏對(duì)小鼠急性皮膚屏障損傷引起炎癥反應(yīng)的抑制作用

仲少敏 郭建美 陶榮 孫楠 吳艷

目的探討夫西地酸乳膏外用對(duì)屏障受損的皮膚炎癥反應(yīng)的作用。方法雄性SKH-1無毛小鼠8只,在每只小鼠背部標(biāo)記6個(gè)1 cm×2 cm的實(shí)驗(yàn)區(qū),分為6組:分別為空白對(duì)照組、屏障破壞組、屏障破壞+夫西地酸組、屏障破壞+基質(zhì)組、屏障完整+夫西地酸組、屏障完整+基質(zhì)組。采用膠帶撕脫法去除角質(zhì)層表皮脂質(zhì),建立急性屏障功能損傷的動(dòng)物模型。局部外用夫西地酸乳膏或基質(zhì),12 h后對(duì)受試部位進(jìn)行菌落采集鑒定,并取皮膚標(biāo)本采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)皮膚中髓樣分化因子88(MyD88)和白細(xì)胞介素(IL)-1α、IL-6以及表皮抗菌肽S100a8和S100a9的表達(dá)。結(jié)果屏障破壞組MyD88 mRNA表達(dá)(8.3±3.0)為空白對(duì)照組(0.8±0.4)的8倍,其IL-1α、IL-6及S100a8和S100a9 mRNA表達(dá)均高于空白對(duì)照組。屏障破壞+夫西地酸組與屏障破壞組比較,IL-1α mRNA水平顯著下降(2.8±0.3比20.1±10.0,F=47.11,P＜0.01),IL-6水平顯著下調(diào)(1.6±2.3比9.4±4.0,F=16.18,P＜0.01),S100a8 mRNA水平顯著下降(1.5±1.4比5.0±1.6,F=59.71,P＜0.05),S100a9 mRNA亦顯著下降(1.2±0.7比3.4±1.6,F=21.94,P＜0.05)。結(jié)論夫西地酸乳膏外用對(duì)于屏障損傷后的炎癥反應(yīng)有明顯的抑制作用,可能為其治療炎癥性皮膚病的作用機(jī)制之一。

梭鏈孢酸;皮膚屏障;髓樣分化因子88;白細(xì)胞介素類

夫西地酸是皮膚科最常用的外用抗生素之一,廣泛用于革蘭陽性球菌的皮膚感染,并在痤瘡治療中占有重要的地位[1]。夫西地酸治療痤瘡切實(shí)有效,但是否與其抗菌作用有關(guān)仍然不確定[2-3]。夫西地酸具有抑菌殺菌和抗炎免疫調(diào)節(jié)的雙重作用,系統(tǒng)用藥可通過增強(qiáng)免疫功能消除細(xì)菌所致的組織水腫、滲出、變性、壞死等炎癥反應(yīng)[4-5]。髓樣分化因子(MyD88)是泛在的胞內(nèi)配體蛋白,為白細(xì)胞介素(IL)-1受體/Toll樣受體(TLR)所介導(dǎo)的前炎癥信號(hào)通路中的關(guān)鍵銜接分子,在微生物入侵、有害刺激時(shí),激活核因子κB(NF-κB)和其他通路,誘導(dǎo)很多快速反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄活化,產(chǎn)生多種效應(yīng)分子,如前炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、抗菌肽等,在天然免疫和炎癥性皮膚病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[6-7]。本研究在屏障破壞的皮膚模型上誘導(dǎo)急性皮膚炎癥反應(yīng)[8-9],在此基礎(chǔ)上外用夫西地酸,觀察其是否具有抗炎活性。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物

雄性SKH-1無毛小鼠8只,生產(chǎn)自上海市公共衛(wèi)生臨床中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部(動(dòng)物檢疫合格證號(hào):3100054868),6～8周齡,質(zhì)量30 g左右。飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(24±2)℃,相對(duì)濕度(50±10)%,人工照明制造晝夜(晝/夜:12 h/12 h)。以Purina Chow為飼料,自由喂養(yǎng)。購(gòu)入后適應(yīng)環(huán)境10～15 d后開始試驗(yàn)。測(cè)試環(huán)境溫度(24±2)℃,相對(duì)濕度45%～55%。2%夫西地酸乳膏及乳膏基質(zhì)由香港澳美制藥廠提供。基質(zhì)配方為凡士林、液體石蠟、西土馬哥及甘油等。

二、屏障損傷模型建立

在每只小鼠背部標(biāo)記6個(gè)1 cm×2 cm的實(shí)驗(yàn)區(qū),分為6組:分別為空白對(duì)照組、屏障完整+夫西地酸組、屏障完整+基質(zhì)組、屏障破壞組、屏障破壞+夫西地酸組、屏障破壞+基質(zhì)組。使用經(jīng)皮水分丟失測(cè)試儀Vapometer(Delfin Technologies Ltd,芬蘭)測(cè)量小鼠皮膚的基礎(chǔ)經(jīng)表皮失水(TEWL)值,屏障破壞區(qū)域應(yīng)用 scotch?膠帶(3M,美國(guó))以相同壓力和速度反復(fù)粘脫約20次,測(cè)量處理局部的TEWL值,使其與基線相比上升超過5倍[9]視為屏障破壞;肉眼可見局部輕微潮紅,少許滲出。隨后局部外用藥物或基質(zhì)1次,12 h后局部菌落鑒定計(jì)數(shù)并處死小鼠,剪取各實(shí)驗(yàn)區(qū)全層皮膚組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

三、菌落鑒定和計(jì)數(shù)

用拭子均勻擦拭皮膚表面,用5 ml滅菌注射用水定量。取25 μl接種至血培養(yǎng)皿,使用接種環(huán)均勻涂抹于血平板上,37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,進(jìn)行菌落鑒定計(jì)數(shù)。

四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR

所采集的皮膚標(biāo)本使用液氮研磨,Omega試劑盒法提取RNA,進(jìn)行cDNA合成,SYBR GREEN MIX(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,采用PRIMER3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物序列見表1所示。mRNA表達(dá)水平用管家基因GAPDH進(jìn)行校正計(jì)算相對(duì)表達(dá)量,即處理組的目的基因相對(duì)于空白對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)(2-ΔΔCt),所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。采用重復(fù)測(cè)量方差分析對(duì)6個(gè)處理組MyD88和IL-1α、IL-6以及表皮抗菌肽S100a8和S100a9的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間比較采用Post Hoc檢驗(yàn)中最小顯著差數(shù)法(LSD法)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、急性屏障破壞12 h的小鼠模型菌落鑒定

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物序列

表2 不同處理組無毛小鼠皮膚中各炎癥因子mRNA的表達(dá)情況(2-ΔΔCt,±s)

表2 不同處理組無毛小鼠皮膚中各炎癥因子mRNA的表達(dá)情況(2-ΔΔCt,±s)

注:Myd88:髓樣分化因子88;S100a8:表皮抗菌肽S100a8;S100a9:表皮抗菌肽S100a9。n=8。與屏障破壞組相比較,a:P＜0.01;b:P＜0.05

組別 Myd88 白細(xì)胞介素-1α白細(xì)胞介素-6 S100A8 S100A9空白對(duì)照組 0.8±0.4 1.3±0.2 1.7±1.5 1.6±1.5 1.2±0.8屏障完整+夫西地酸組 1.4±1.0 3.1±3.2 2.0±1.9 2.4±1.6 1.1±1.2屏障完整+基質(zhì)組 2.0±1.4 2.8±2.7 1.5±1.2 2.8±1.2 0.8±0.2屏障破壞組 8.3±3.0 20.1±10.0 9.4±4.0 5.0±1.6 3.4±1.6屏障破壞+夫西地酸組 3.2±2.3a 2.8±0.3a 1.6±2.3b 1.5±1.4b 1.2±0.7b屏障破壞+基質(zhì)組 6.8±3.5 11.2±4.7 8.2±5.0 4.1±2.0 3.4±1.3 F值 86.94 47.11 16.18 59.71 21.94 P值 0.01 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

在皮膚屏障功能破壞12 h后,在局部進(jìn)行菌落采集,培養(yǎng)鑒定發(fā)現(xiàn)沒有明顯的菌落,僅有極少量雜菌生長(zhǎng),為金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌,各組間無差別,無臨床感染的證據(jù)。

二、夫西地酸抑制皮膚屏障破壞引起的MyD88表達(dá)上調(diào)

皮膚屏障破壞組MyD88 mRNA表達(dá)顯著升高,為空白對(duì)照組的8倍(P＜0.01),屏障破壞+夫西地酸組明顯低于屏障破壞組(P＜0.01),屏障破壞+基質(zhì)組與屏障破壞組比較未見明顯下降(表2)。屏障完整+夫西地酸組與屏障完整+基質(zhì)組無明顯變化。

三、夫西地酸抑制屏障破壞引起的炎癥因子IL-1α、IL-6的合成

屏障破壞組IL-1α、IL-6 mRNA表達(dá)顯著升高,相對(duì)表達(dá)量分別為空白對(duì)照組的20倍(P＜0.01)及9倍(P＜0.01),屏障破壞 +夫西地酸組明顯低于屏障破壞組(P＜0.001),屏障破壞+基質(zhì)組與屏障破壞組比較未見明顯下降(表2)。屏障完整+夫西地酸組與屏障完整+基質(zhì)組無明顯變化。

四、夫西地酸減少屏障破壞引起的表皮抗菌肽S100a8、S100a9的合成

皮膚屏障破壞組表皮抗菌肽S100a8、S100a9 mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組明顯升高,屏障破壞+夫西地酸組明顯低于屏障破壞組(P＜0.05)(表2)。屏障完整+夫西地酸組與屏障完整+基質(zhì)組無明顯變化。

討 論

在皮膚科夫西地酸外用非常廣泛,因?yàn)槠錅睾蜎]有刺激,滲透性好,非常適合痤瘡等屏障功能受損不能耐受刺激性藥物的炎癥性皮膚病[10]。關(guān)于夫西地酸對(duì)皮膚在抗菌作用之外是否具有直接的抗炎作用,目前還沒有直接的證據(jù),因此我們?cè)谄つw屏障損傷模型上觀察其外用對(duì)炎癥因子的影響。

IL-1是最強(qiáng)效的前炎癥因子之一,在角質(zhì)形成細(xì)胞中構(gòu)成性表達(dá),在皮膚損傷、紫外線照射、過敏反應(yīng)和感染時(shí)快速釋放,并與IL-1受體I(IL-1RI)結(jié)合,通過募集銜接蛋白MyD88,啟動(dòng)下游的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng),激活NF-κB和其他信號(hào)通路(包括JNK和MAPK),導(dǎo)致更多的IL-1和其他炎癥介質(zhì)產(chǎn)生,在皮膚的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中起非常重要的作用[11]。如果炎癥反應(yīng)過度或者不能達(dá)到平衡就會(huì)造成組織破壞,這也是包括痤瘡在內(nèi)的多種感染性、炎癥性和自身免疫性皮膚病的發(fā)病機(jī)制之一[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn),急性屏障功能破壞可以引起MyD通路激活,其下游的炎癥因子IL-1α、IL-6合成增加,這一反應(yīng)曾在紫外線損傷和其他的皮膚炎癥狀態(tài)中被反復(fù)觀察到,為急性屏障功能破壞的特征性表現(xiàn)[14],說明膠帶撕脫法成功破壞屏障,并導(dǎo)致炎癥通路的激活,推測(cè)MyD88通路可能是其作用的靶點(diǎn)。外用夫西地酸乳膏對(duì)炎癥因子IL-1α、IL-6的釋放有顯著的抑制作用,說明夫西地酸有直接的抗炎癥作用,在炎癥損傷過度時(shí)可以為組織提供保護(hù)。

本研究還發(fā)現(xiàn),夫西地酸乳膏可以降低表皮抗菌肽S100A8和S100A9的表達(dá)。在特應(yīng)性皮炎、銀屑病等炎癥性皮膚病中都有S100A8高表達(dá),與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。另一方面,細(xì)胞外S100A8蛋白還可與Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合,通過MyD88通路激活刺激炎癥細(xì)胞釋放炎癥蛋白和炎癥介質(zhì),直接參與炎癥疾病過程并介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)通路和生物學(xué)過程[15]。夫西地酸對(duì)S100A8和S100A9的抑制作用可能為其抗炎機(jī)制之一。

我們另設(shè)基質(zhì)對(duì)照,除外了基質(zhì)效應(yīng),并對(duì)屏障破壞的皮膚表面進(jìn)行菌落采集鑒定,各組都沒有明顯細(xì)菌感染的證據(jù),說明炎癥反應(yīng)并非細(xì)菌感染所致,對(duì)炎癥因子的抑制作用也并非夫西地酸的抗菌作用。夫西地酸對(duì)屏障破壞的皮膚具有直接的抗炎作用,這為臨床指導(dǎo)治療和進(jìn)一步明確其作用機(jī)制提供了直接證據(jù)。

聲明本課題獲2013年中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)“CAIM-澳美中國(guó)痤瘡研究基金”資助

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2014-03-09)

(本文編輯:尚淑賢)

Inhibitory effect of fusidic acid cream on inflammatory reaction caused by acute skin barrier damage in mice

Zhong Shaomin，Guo Jianmei，Tao Rong，Sun Nan，Wu Yan.Department of Dermatology，Peking University First Hospital，Beijing 100034，China

Wu Yan，Email:adelewu@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the effect of fusidic acid cream on inflammatory reaction caused by skin barrier damage.MethodsEight male SKH-1 hairless mice were included in this study.The back of each of these mice were equally divided into six regions measuring 1 cm × 2 cm in size，which were then assigned into six groups:blank control group remaining untreated，barrier-impaired group，barrier-impaired and fusidic acid-treated group，barrier-impaired and vehicle-treated group，barrier-unimpaired and fusidic acid-treated group，barrierunimpaired and vehicle-treated group.Stratum corneum was removed by adhesive tape stripping to establish an animal model of acute skin barrier damage in the corresponding skin regions of these mice，and fusidic acid cream or vehicle was topically applied to the corresponding regions once.Twelve hours later，skin surface swab samples were collected from the back of these mice followed by bacterial culture and colony counting.Mice were then sacrificed，and skin tissue specimens were resected from these mice，and subjected to real-time fluorescence-based quantitative PCR for the measurement of the mRNA expressions of myeloid differentiation factor 88(MyD88)，interleukin-1α (IL-1α)，IL-6，epidermal antibacterial peptides S100a8 and S100a9.Statistical analysis was carried out by repeated-measures analysis of variance(ANOVA)and least significant difference(LSD)test.ResultsThe mRNA expressions of MyD88，IL-1α，IL-6，S100a8 and S100a9 were all significantly higher in the barrier-impaired group than in the blank control group(allP＜ 0.05).Specifically，the mRNA expression level of MyD88 in the barrier-impaired group was 8 times that in the blank control group(8.3±3.0 vs.0.8±0.4).Compared with the barrier-impaired group，the barrier-impaired and fusidic acid-treated group showed a significant decrease in the mRNA expressions of IL-1α (2.8±0.3 vs.20.1±10.0，F(xiàn)=47.11，P＜0.01)，IL-6(1.6±2.3 vs.9.4±4.0，F(xiàn)=16.18，P＜ 0.01)，S100a8(1.5± 1.4 vs.5.0± 1.6，F(xiàn)=59.71，P＜ 0.05)and S100a9(1.2± 0.7 vs.3.4 ± 1.6，F(xiàn)=21.94，P＜ 0.05).ConlusionsFusidic acid cream could attenuate the inflammatory reaction caused by acute skin barrier damage，which might partly explain its action mechanism in the treatment of inflammatory skin diseases.

Fusidic acid;Skin barrier;Myeloid differentiation factor 88;Interleukins

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.009

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科

吳艷,Email:adelewu@medmail.com.cn