痣樣基底細胞癌綜合征一家系PTCH1基因突變分析

高第 黃二順 孫婷婷 閆慧敏 尤艷明 姜薇

痣樣基底細胞癌綜合征一家系PTCH1基因突變分析

高第 黃二順 孫婷婷 閆慧敏 尤艷明 姜薇

目的對痣樣基底細胞癌綜合征一家系進行PTCH1基因突變分析。方法提取先證者(Ⅱ5)及Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅲ4的DNA,以50例健康人為對照。應用聚合酶鏈反應(PCR)、DNA直接測序明確突變位點,根據突變位點設計特異性引物,用PCR來檢測突變位點從而進一步確定該家系的致病原因。結果先證者PTCH1基因的1條等位基因第14號外顯子上2137位胞嘧啶C被胸腺嘧啶T替代(c.2137C＞T),即CAG→TAG,導致終止密碼產生(Q714X),Ⅲ4也檢測到相同突變。健康對照者中未檢出該突變。結論PTCH1基因的無義突變(c.2137C＞T)可能是引起該患者臨床癥狀的特異性突變。

痣樣基底細胞癌綜合征;PTCH1基因;密碼子,無義

痣樣基底細胞癌綜合征(nevoid basal cell carcinoma syndrome,簡稱:NBCCS;MIM#109400)是一種單基因常染色體顯性遺傳病,具有很高的外顯性和多種臨床表現,以腫瘤的發生和遺傳為特征。目前被證實此病的致病基因有3個:分別為位于9q22的PTCH1(PTCH1:patched homologue1)(601309)基因,位于1p32的PTCH2(PTCH2:patched homologue2)(603673)基因和位于10q24-q25的SUFU(SUFU:suppressor of fused homolog)[1]基因,其中PTCH1突變最為常見。我們對一痣樣基底細胞癌綜合征家系進行PTCH1基因突變研究。

對象與方法

一、臨床資料

圖1 痣樣基底細胞癌綜合征患者家系圖

先證者男(Ⅱ5),58歲。主因全身散在結節、斑塊30余年由門診入院。患者30多年前無明顯誘因左下瞼出現一綠豆大小丘疹,淡褐色,漸增大,無自覺癥狀。10余年前,因左下瞼皮損增大,表面破潰,在當地醫院手術切除,植皮修復創面,診斷不明。皮損漸增多,頭皮、耳后、陰囊、下肢出現多個綠豆至杏大小結節、斑塊,部分隆起,部分表面破潰、糜爛,形成淺潰瘍。2個月前左眼玻璃體出血造成左眼視力障礙來我院眼科。既往史及個人史:1997年患腦梗死,治愈。否認其他疾病史。在化肥廠水系車間工作。其父母、2個哥哥均無類似疾病史。育1子28歲(圖1,Ⅲ4),健康,僅見雙手掌點狀凹坑,未見其他皮損。皮膚科情況:全身可見散在綠豆至杏大小淡褐色、黑褐色丘疹、斑塊,部分表面破潰、糜爛、潰瘍形成,部分隆起呈疣狀。左下眼瞼輕度外翻,鼻根稍寬,眼距增寬,左眼斜視(圖2a)。掌跖可見1～2 mm大小凹陷(圖2b)。分別取顳部(圖2c)和頸部(圖2d)皮損,組織病理均顯示為基底細胞癌(圖3)。頭顱CT(圖4):大腦鐮、小腦幕、硬腦膜及頭皮軟組織內多發鈣化灶。

圖2 痣樣基底細胞癌綜合征先證者的臨床表現 2a:左下眼瞼輕度外翻,鼻根稍寬,眼距增寬;2b:右手掌可見1～2 mm大小凹陷;左顳部(2c)和右頸部(2d)黑色斑塊,部分表面破潰,潰瘍形成

圖3 先證者組織病理檢查:顳部(3a)、頸部(3b)真皮內嗜堿性基底樣細胞團塊,腫瘤周圍細胞呈柵狀排列,瘤體與周圍組織之間出現收縮間隙(HE×40)

圖4 先證者頭顱CT檢查 大腦鐮(4a)、小腦幕(4b)多發鈣化灶(箭頭所示)

二、方法

1.DNA提取:收集家系中先證者及其兒子和兩個哥哥以及50例健康對照者靜脈血5ml,利用DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)提取DNA。本研究方案得到北京大學第三醫院倫理委員會批準,研究對象(包括患者和健康人)均簽署知情同意書。

2.PCR和直接測序:PTCH1基因的引物設計采用軟件Primer3,在設計引物時,PTCH1基因的23個外顯子被分成23個片段。其中擴增14號外顯子合成的引物:上游5′-TG GCAGAATGAAAGCACCAT-3′,下游 5′-AGCAATCTGATGAAC TCCAAAGG-3′。 PCR反應采用 50 μl體系, 包括:上、下游引物各10 pmol/L,dNTP 10 mmol/L,MgCl215 mmol/L,Taq酶2.5 U以及100 ng的樣本DNA。PCR擴增條件為94℃預變性5 min后進入循環,94℃變性30 s,退火58℃30 s,72℃延伸30 s,33個循環后72℃延伸7 min。PCR產物用10 g/L瓊脂糖凝膠(溴化乙錠染色)電泳分析,經酶純化后用ABIPrism377型全自動測序儀測序(北京天一輝遠測序公司)。

3.等位基因特異性引物PCR:根據第14號外顯子上發生的c.2137C＞T的替代突變,設計3′末端引物。野生型:上游5′-CGCAGATTACCATGCAG TCC-3′,下游 5′-GGGAGAGCAGGTCCCTTGTG-3′。突變型: 上游 5′-CGCAGATTACCATGCAGTCC-3′,下游 5′-AGGAGAGCAGGTCCCTTGTG-3′。 PCR 產物用15 g/L瓊脂糖凝膠(溴化乙錠染色)電泳分析。

結 果

對23個PCR產物全部測序,結果與基因庫(NM-000264.2)中正常序列相比較。先證者PTCH1的1條等位基因上14號外顯子2317位胞嘧啶C被胸腺嘧啶T替代(c.2137C＞T)即CAG→TAG。在健康對照中未發現該突變。對先證者的2個哥哥(Ⅱ1、Ⅱ3)以及先證者的兒子(Ⅲ4)的第14號外顯子進行擴增并直接測序,證實其2個哥哥未發現該突變,但先證者的兒子存在此種無義突變(圖5)。

討 論

圖5 痣樣基底細胞癌綜合征先證者和其子的基因組DNA PCR產物直接測序結果 先證者(5a)和其兒子(5b)PTCH1基因14號外顯子2317位發生C＞T替代,即CAG→TAG,導致終止密碼(Q714X)的產生。5c為正常序列

NBCCS是一種常染色體顯性遺傳性疾病,常見于白種人,發病率為1/150 000～1/57 000[1]。 其特征是多發性基底細胞癌,頜骨牙源性囊腫,手、足部點狀凹陷,肋骨、脊柱及頭顱骨畸形以及多種其他疾患。常伴有大腦鐮及小腦幕的鈣質沉積。其特征性面容為額部隆起、上頜發育不全、寬鼻根及眼距增寬。目前診斷依據1997年Kimonis等[2]新修訂的診斷標準。我們的患者表現為多發基底細胞癌,特征性的面容,手足坑狀凹陷,頭顱大腦鐮、小腦幕、硬腦膜多發鈣化灶,最后診斷為NBCCS。

目前證實NBCCS的致病基因有3個,分別為PTCH1、PTCH2和SUFU。PTCH1基因是腫瘤監視基因,此基因與果蠅發育基因PTC(patched)同源,PTC基因為果蠅節極性基因[3-4]。自從1996年證實該病與PTCH1基因突變有關以來,全世界大約報道280余個位點發生突變[3，5]。PTCH1基因全長約34 kb,包括23個外顯子,編碼1 447個氨基酸的蛋白質,包括12個跨膜區,2個大的胞外區和1個大的胞內區[6]。PTCH蛋白作為SHH(secreted sonic hedgehog)蛋白的受體,通過抑制SMO蛋白(另一種跨膜蛋白)的活性,從而抑制SHH信號傳導通路[7-9]。SHH信號傳導通路與組織器官的生長發育有關,當信號通路發生異常時,會引起疾病的發生[4，10]。最近有研究顯示,突變發生在上述大的胞內區可導致細胞增殖以及細胞內信號轉導不受控制[11],因此可以解釋在NBCCS患者中出現先天發育異常及腫瘤的表現。我們通過檢測發現,先證者PTCH1基因的無義突變(c.2137C＞T,14號外顯子)恰好發生在大的胞內區,導致PTCH蛋白合成提前終止(Q714X),使得細胞增殖以及細胞內信號轉導不受控制,從而導致NBCCS的產生。健康人中未發現該突變。證實該突變是導致該患者發病的主要原因。Marsh等[12]曾報道一澳大利亞患者存在相同突變。

通過基因檢測我們發現,先證者之子同樣存在該無義突變,然而我們僅發現其掌跖部位的點狀凹坑,未見基底細胞癌及NBCCS的其他表現。進一步文獻檢索發現,Goldstein等[13]觀察到NBCCS中最常見的3個臨床表現分別為頜骨囊腫、掌跖皮膚點狀凹陷及大腦鐮鈣化,而這其中又以掌跖皮膚的點狀凹陷發生率最高。Kimonis等[2]報道在NBCCS患者中87%會出現掌跖點狀凹陷,出現這種表現的患者最小年齡僅有5歲。Kimonis等[14]進一步指出,掌跖的點狀凹陷是NBCCS的一個重要特征,其在兒童和成人的發生率相同。通過這一發現,我們認為對可疑NBCCS患者及直系親屬進行仔細全面的系統檢查(尤其需要注意雙掌跖的點狀凹坑)以及基因學檢測對NBCCS的早期診斷都是有意義的。因為NBCCS患者的早期預防(盡量較少紫外線暴露或外出時注意防曬)可以延緩基底細胞癌的發展進程[14]。因此,我們對該家系PTCH1基因突變的分析不僅對研究基因型與表型之間的關系具有意義,還對家系中有PTCH1基因突變者(先證者之子)進行早期干預,預防其發展為基底細胞癌。

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2014-01-20)

(本文編輯:尚淑賢)

Mutation analysis of the PTCH1 gene in a pedigree with nevoid basal cell carcinoma syndrome

Gao Di，Huang Ershun，Sun Tingting，Yan Huimin，You Yanming，Jiang Wei.Department of Dermatology，Peking University Third Hospital，Beijing 100191，China

Jiang Wei，Email:jiangwei@medmail.com.cn

ObjectiveTo analyze mutations in the PTCH1 gene in a pedigree with nevoid basal cell carcinoma syndrome(NBCCS).MethodsBlood samples were collected from a 58-year-old male proband with NBCCS(Ⅱ5)，his brothers(Ⅱ1 andⅡ3)and son(Ⅲ4)，and 50 unrelated healthy human controls.DNA was extracted from these blood samples.PCR and direct DNA sequencing were performed to determine mutation sites in the PTCH1 gene.According to the mutation sites，allele-specific oligonucleotide primers were designed and used to confirm the pathogenic mutations in this pedigree through PCR.ResultsA nonsense mutation(c.2137C)，which leads to the substitution of CAG by TAG with the generation of a premature termination codon(Q714X)，was identified in exon 14 in one allele of the PTCH1 gene in the proband and his son，but in none of the healthy human controls.ConclusionThe nonsense mutation(c.2137C＞T)in the PTCH1 gene may be a specific mutation causing the clinical symptoms in the patient with NBCCS.

Nevoid basal cell carcinoma syndrome;PTCH1 gene;Codon，nonsense

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.008

國家自然科學基金青年基金(81201216)

100191北京大學第三醫院皮膚科

姜薇,Email:jiangwei@medmail.com.cn