人瘢痕疙瘩成纖維細胞裸鼠荷瘤模型的建立

朱蓮花 萬紅雙 金明姬 方宇輝 李周娜 金哲虎 高鐘鎬

人瘢痕疙瘩成纖維細胞裸鼠荷瘤模型的建立

朱蓮花 萬紅雙 金明姬 方宇輝 李周娜 金哲虎 高鐘鎬

目的建立一種簡單、成功率高的人瘢痕疙瘩裸鼠荷瘤模型。方法27只雌性BALB/c裸鼠隨機分為5組,A、B、C組每組5只,在每只裸鼠腋窩下接種人瘢痕疙瘩成纖維細胞和Matrigel膠混懸液0.1 ml,細胞濃度分別為 1.0 × 104個/μl Matrigel膠(A 組)、3.0 × 104個/μl Matrigel膠(B 組)、5.0 × 104個/μl Matrigel膠(C組)。取C組成形瘤塊修剪成若干個5 mm×5 mm×5 mm大小的組織塊移植于D組裸鼠(8只)的腋窩皮下;E組裸鼠(4只)皮下注射100 μl Matrigel膠作為對照組。A、B、C組出瘤后30 d、D組瘤塊移植后30 d肉眼觀察瘤體的形成過程及變化,并在第31天處死裸鼠進行組織病理學檢查,分析其移植后成形的瘤體組織學變化及裸鼠的心、肝、脾、肺、腎組織的變化。結果A、B、C組裸鼠成瘤率為100%,出瘤時間分別為(90.20±3.96)d、(61.00±2.92)d、(39.60±3.20)d。 出瘤 30 d時 3組瘤體體積分別為(288.34±25.29)mm3、(1 370.63±105.24)mm3、(1 940.98±184.37)mm3,3組差異有統計學意義(F=138.74,P＜0.05)。D組裸鼠成形瘤塊移植后瘤塊體積先略增大后逐漸減小,移植第14天始持續增大,8只中7只成瘤。E組裸鼠未見瘤體形成。組織病理學檢查,各組瘤體的組織形態在鏡下一致,與人瘢痕疙瘩組織相似,未見其他臟器組織學改變及轉移瘤灶。結論裸鼠皮下接種人瘢痕疙瘩成纖維細胞可建立瘢痕疙瘩裸鼠荷瘤模型,而且已成瘤組織修剪成一定體積再次移植于裸鼠皮下也可以建立瘢痕疙瘩裸鼠荷瘤模型。

瘢痕疙瘩;成纖維細胞;疾病模型,動物

瘢痕疙瘩是以膠原蛋白和成纖維細胞堆積為特點的纖維增生性疾病[1],臨床上尚沒有特效治療方法,復發率極高[2]。曾有研究者嘗試用鼠、兔或其他動物研究瘢痕疙瘩[3-4],但它們的創傷愈合結果都與人類形成的瘢痕疙瘩差異較大[5]。在腫瘤動物模型的建立中,體外腫瘤細胞培養后接種于動物體內是常用的建模方法[6],Matrigel膠是制備腫瘤動物模型常用的輔助材料,在4℃下呈液體狀態,而在室溫條件下,聚合形成具有生物學活性的三維基質,能模擬體內細胞基底膜的結構,與腫瘤細胞混合后接種能縮短成瘤時間,提高成瘤率[7]。我們利用Matrigel膠的此特性與人瘢痕疙瘩成纖維細胞混合后,移植于裸鼠皮下,制備瘢痕疙瘩裸鼠荷瘤模型,為今后研究瘢痕疙瘩的作用機制及治療提供基礎。

材料和方法

一、實驗動物

健康雌性BALB/c裸鼠27只,SPF級,6～8周齡,體重20～22 g,由北京維通利華公司提供,合格證號:11400700023588。飼養于中國醫學科學院藥物研究所動物飼養中心。

二、實驗材料

DMEM培養液、磷酸鹽緩沖液(PBS),美國HyClone公司;胎牛血清,美國Gibco公司;消化液(0.25%胰蛋白酶、0.03%EDTA)、凍存液,北京協和基礎醫學細胞中心;Matrigel膠,美國BD公司。

三、實驗方法

1.細胞培養:人瘢痕疙瘩成纖維細胞(CRL-1762)由上海麗臣生物技術有限公司保存傳代,采用含10%胎牛血清的DMEM培養液,在37℃、5%CO2培養箱中培養,3 d換液1次,細胞長滿90%時傳代,取第3～5代細胞用于實驗。

2.細胞處理:取對數生長期瘢痕疙瘩成纖維細胞,PBS沖洗2次,加入適量消化液消化,取細胞懸液離心,棄上清,加無血清DMEM培養基制成單細胞懸液,計數后再次離心,棄上清,置于冰上,加入Matrigel膠,吹打混勻,調整細胞密度分別為1.0×104個/μl Matrigel膠,3.0 × 104個/μl Matrigel膠,5.0 ×104個/μl Matrigel膠。

3.細胞接種:27只裸鼠隨機分為5組。A、B、C組各5只,分別于裸鼠右腋窩下接種1.0×104、3.0×104、5.0 × 104個成纖維細胞/μl Matrigel膠, 每只接種1點,接種量為0.1 ml。D組8只,取C組成瘤瘤體組織,無菌環境下修剪成5 mm×5 mm×5 mm,在D組裸鼠右腋窩處皮膚消毒后做一切口,長約1 cm,在距離切口一定距離的皮下潛行分離腔隙,將修剪后的瘤體組織包埋于裸鼠皮下,切口處絲線縫合。E組4只,注射0.1 ml Matrigel膠作為對照組。術后觀察成瘤情況,并記錄瘤體大小(測瘤體長徑a與短徑b,體積V=a×b2/2)和裸鼠體重。

4.組織病理學檢查:以成纖維細胞接種后出現皮下結節,直徑大于0.5 cm記為出瘤時間[8]。各組裸鼠出瘤后30 d處死,取出瘤體及裸鼠的心、肝、脾、肺、腎,4%甲醛固定,石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下觀察瘤體的組織學形態及裸鼠的內臟組織形態學改變。

5.統計學處理:用SPSS17.0軟件進行統計學分析,計量資料以±s表示,各組間瘤體體積比較用方差分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、成纖維細胞接種后成瘤情況

圖1 人瘢痕疙瘩成纖維細胞接種雌性BALB/c裸鼠右腋窩下后形成的皮下瘤

圖2 雌性BALB/c裸鼠右腋窩處瘤塊移植后3 d瘤體情況(D組)

見圖1。A、B、C組裸鼠成瘤率為100%,出瘤時間分別為(90.20 ± 3.96)d、(61.00 ± 2.92)d、(39.60 ±3.20)d。出瘤后30 d時A組瘤體體積為(288.34±25.29)mm3,B組為(1 370.63±105.24)mm3,C組為(1 940.98±184.37)mm3,A、B、C組瘤體體積比較,差異有統計學意義(F=138.74,P＜0.05)。E組裸鼠未見瘤體形成。

二、瘤塊移植后成瘤情況

D組裸鼠皮下移植瘤塊后3 d切口基本愈合,見圖2。瘤體移植后體積稍有增加,4 d后逐漸減小,14 d左右開始持續增大(圖3)。其中1只由于移植時瘤塊組織與切口過于靠近,小部分瘤體組織與切口相連或外露,瘤塊在切口愈合過程中逐漸結痂至消失,故D組8只中7只成瘤。

三、瘤體組織肉眼觀察

A、B、C、D組裸鼠皮下瘤體均為實體瘤,圓形或橢圓形,瘤體生長部位可見新生血管形成,瘤體包膜完整,未侵襲周圍組織。瘤體橫切面呈淡紅色,質軟(圖4)。

圖3 雌性BALB/c裸鼠右腋窩處瘤塊移植后瘤體體積變化

四、組織病理學檢查

A、B、C組與D組裸鼠皮下瘤鏡下結構一致,成纖維細胞密集排列,呈放射狀、漩渦狀走行,與人瘢痕疙瘩組織相似(圖5)。各組裸鼠的心、肝、脾、肺、腎組織HE染色結果未見組織病理學改變和轉移瘤灶。

討 論

圖4 雌性BALB/c裸鼠右腋窩處移植瘤的肉眼觀察 4a:解剖時完整瘤體;4b:瘤體的橫切面圖

圖5 雌性BALB/c裸鼠瘤體組織的組織學形態(HE×100) 5a～5c:分別為接種1.0×104、3.0×104、5.0×104個成纖維細胞/μl Matrigel膠組;5d:瘤塊移植組。4組裸鼠皮下瘤鏡下結構一致,成纖維細胞密集排列,呈放射狀、漩渦狀走行

目前應用較多的瘢痕疙瘩動物模型是臨床上手術切下的人瘢痕疙瘩組織剪成小塊后植入到裸鼠皮下制備而成[9],但這種方法制備模型有時限性,必須在瘢痕疙瘩離體后2～3 h內移植到裸鼠皮下,否則瘢痕疙瘩組織壞死導致建模失敗。Wang等[10]從人瘢痕疙瘩組織中分離出成纖維細胞,并在體外培養后接種到一種新型高空隙率海綿狀聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)的支架上,將該支架旋轉培養1周后植入到裸鼠皮下,建立瘢痕疙瘩模型。但此方法對生物材料、培養系統和操作技術要求較高,很難普遍應用于瘢痕疙瘩的研究中。在腫瘤模型的建立中,較常用的是將人或動物的腫瘤組織或細胞移植到動物體內形成腫瘤模型,目前較成熟的腫瘤模型有結腸癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌模型等[3]。考慮瘢痕疙瘩具有侵襲性生長的特性和難治的臨床癥狀,類似于腫瘤,但其生長速度緩慢,無遠處轉移,也有人將其定義為良性腫瘤[11]。因此,本實驗模擬腫瘤的建模方法,將人瘢痕疙瘩成纖維細胞與Matrigel膠混合接種于裸鼠皮下,建立了瘢痕疙瘩動物模型。

本實驗中細胞接種模型的出瘤時間與接種細胞密度明顯相關,密度高者出瘤快,雖然每組裸鼠均形成皮下瘤,但接種量為1.0×104/μl Matrigel膠時,出瘤時間長達90 d,此時裸鼠生命狀態已開始逐漸下降,皮膚變薄,出現衰老跡象,瘤體增長緩慢,不利于后期實驗研究,不推薦應用此密度建立模型。當接種量為3.0×104/μl Matrigel膠和5.0×104/μl Matrigel膠時,平均出瘤時間分別為61 d和40 d,整個觀察過程中均未發現瘤體失控性生長和壞死,是較合適的接種密度。而且由此推測,如果增加細胞接種量,出瘤時間有可能提前,這還需通過更多的實驗證實。考慮到大批量建立動物模型時需要細胞較多,同時接種工作量非常大,故本實驗將已成形瘤塊繼續移植到其他裸鼠體內,即把經細胞接種后形成的瘤體切成若干小塊,分別移植到裸鼠皮下,由于本實驗中A組和B組出瘤時間較長,而C組成瘤較快,故只將C組成形瘤塊進行分割移植,其他密度細胞接種形成的瘤塊移植后的生長情況還需進一步考察。D組裸鼠瘤塊移植后瘤塊體積略增大后逐漸縮小甚至小于移植時瘤塊大小,這可能由于植入時皮下組織創傷形成水腫,導致體積略增大,隨后移植組織部分被吸收,體積減小;至移植后14 d左右瘤體開始持續性增大,說明移植瘤周圍已形成新生血管,瘤體開始成活生長。有研究表明,在裸鼠皮下移植人瘢痕疙瘩組織時,在移植后16 d已有血管形成[12],這與本實驗結果接近。本實驗中瘤塊移植方法能降低細胞培養的工作量,在建模時先以高濃度細胞接種幾只裸鼠,將得到的瘤塊分割后分別移植到多只裸鼠皮下,同時獲得較多的模型,而且組織學觀察發現移植后成活的瘤塊與人瘢痕疙瘩成纖維細胞接種所得瘤塊未見明顯差異,也可以用此方法建立瘢痕疙瘩裸鼠荷瘤模型。另外,本實驗瘤塊移植組中有1例可能瘤塊與切口過于靠近,在切口愈合的過程中瘤塊組織與切口共同形成結痂后逐漸消失,因此,瘤塊移植時應在距離切口一定距離的皮下潛行分離腔隙,并妥善固定組織塊,避免移植組織外露,可以有效提高瘤塊移植的成功率。

通過本次實驗研究,初步確定了人瘢痕疙瘩成纖維細胞結合Matrigel膠于裸鼠皮下接種的可成瘤性,成功建立了人瘢痕疙瘩成纖維細胞接種模型和瘤塊移植模型。本課題組還將進行以下方面的深入研究:Matrigel膠中本身含有Ⅳ型膠原、基質金屬蛋白酶、生長因子等,可能會對某些實驗研究造成影響,模型應用時應盡量減少Matrigel膠的干擾作用或者篩選更合適的移植材料;本實驗針對細胞接種數量進行了考察,還需要研究細胞的傳代代數和細胞活性對成瘤結果的影響,并進一步探討瘤塊的細胞成分和來源以及瘤塊傳代后的變化;也將與人瘢痕疙瘩組織塊裸鼠移植模型進行比較,觀察兩者成纖維細胞有無差異性。以上問題的深入解決將使此模型的建立更加合理、可靠,適用廣泛。

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2014-03-19)

(本文編輯:顏艷)

Establishment of a keloid model in nude mice with human keloid-derived fibroblasts

Zhu Lianhua*，Wan Hongshuang，Jin Mingji，Fang Yuhui，Li Zhouna，Jin Zhehu，Gao Zhonggao.*Department of Dermatology，Yanbian University Hospital，Yanji 133001，Jilin，China

s:Jin Zhehu，Email:jinzh-621@163.com;Gao Zhonggao，Email:zggao@imm.ac.cn

ObjectiveTo establish a simple and efficient method for developing a keloid model in nude mice with human keloid-derived fibroblasts.MethodsTwenty-seven female BALB/c nude mice were randomly divided into five groups with 5，5，5，8 and 4 mice in group A，B，C，D and E respectively.The mice in group A，B and C were inoculated with 0.1 ml of suspension containing human keloid-derived fibroblasts at concentrations of 1.0 × 104，3.0 × 104and 5.0 × 104per microliter Matrigel，respectively，at the right axillary fossa.The tumors that formed in one mouse in group C were taken out，and cut into several parts measuring 5 mm × 5 mm × 5 mm in size，which were then subcutaneously transplanted into the right axillary fossa of mice in group D.The mice in group E were subcutaneously injected with 100 μl of Matrigel and served as the control group.The formation of tumor in mice was observed by naked eyes，and the size of tumors was measured until day 30 after tumor formation in group A，B and C as well as after tumor transplantation in group D.Mice were sacrificed on day 30 after tumor formation，and histopathologic examination was performed to analyze histological features of transplanted tumors and pathological changes in visceral organs such as heart，liver，spleen，lung and kidney.ResultsThe tumor formation rate was consistently 100%in group A，B and C，and the time required for tumor formation was(90.20 ± 3.96)，(61.00±2.92)and(39.60±3.20)days in group A，B and C respectively.There was a significant difference in tumor volume on the 30thday after tumor formation between group A，B and C((288.34±25.29)vs.(1 370.63±105.24)vs.(1 940.98 ± 184.37)mm3，F=138.74，P＜ 0.05).The size of implanted tumor mass in group D firstly increased，then gradually decreased，but began to continuously increase since the 14thday，and tumor finally formed in 7 out of 8 mice.There was no evidence of tumor formation in group E.Histopathologic examination showed uniform histological manifestations，which were similar to those of human scar，in tumor tissues from mice in group A，B，C and D.Neither pathological changes nor metastases were observed in visceral organs of these mice.ConclusionKeloid-bearing nude mouse model can be established by subcutaneous inoculation with human keloidderived fibroblasts，or by subcutaneous transplantation of tumor masses of a certain size that have formed in nude mice.

Keloid;Fibroblasts;Disease models，animal

412-4030.2014.12.003

國家自然科學基金(81260233、81373342);2013年吉林省產業技術研究與開發專項項目計劃(2013C034);吉林省教育廳“十二五”科技研究項目;吉林省衛生廳科研課題(2011Z085);北京市自然科學基金(2141004)

133001吉林延吉,延邊大學附屬醫院皮膚科(朱蓮花、萬紅雙、方宇輝、李周娜、金哲虎);中國醫學科學院藥物研究所(金明姬、高鐘鎬)

金哲虎,Email:jinzh-621@163.com;高鐘鎬,Email:zggao@imm.ac.cn