甘露糖結合凝集素在尋常性銀屑病皮損中的表達

蘇英 郭淑蘭 于曉靜 李春陽 孫青

·論著·

甘露糖結合凝集素在尋常性銀屑病皮損中的表達

蘇英 郭淑蘭 于曉靜 李春陽 孫青

目的檢測甘露糖結合凝集素(MBL)在尋常性銀屑病患者皮損中的表達,初步探討皮膚中MBL蛋白與銀屑病發病的關系。方法采用免疫組化法和Western印跡檢測30例進行期尋常性銀屑病患者皮損、非皮損區皮膚(皮損周圍外觀正常皮膚)及30例健康人對照皮膚中MBL的表達。采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析,組間資料比較采用t檢驗。結果免疫組化檢測顯示,銀屑病皮損區MBL呈現陽性表達(相對表達量為0.636 7±0.515 1),非皮損區及健康對照皮膚中MBL表達弱或幾乎無表達(分別為0.416 3±0.160 1和0.381 6±0.310 9),銀屑病皮損區較非皮損區和健康對照皮膚顯著升高(t值分別為2.24和2.32,均P＜0.05),非皮損區與健康對照皮膚MBL表達水平間比較差異無統計學意義(t=1.51,P＞0.05)。Western印跡檢測結果顯示,銀屑病皮損區、非皮損區及健康對照皮膚中均有MBL蛋白表達,相對表達量分別為0.273 1±0.129 4、0.186 3±0.193 1、0.149 2±0.268 7,銀屑病皮損區較非皮損區及健康對照皮膚顯著增高(t值分別為2.05和2.28,均P＜0.05),非皮損區與健康對照皮膚表達差異無統計學意義(P＞0.05)。結論銀屑病患者皮損區MBL蛋白高表達,可能與銀屑病的發病存在一定關系。

銀屑病;甘露糖結合凝集素類;免疫,天然

天然免疫紊亂在銀屑病發病過程中發揮重要作用[1-3]。甘露糖結合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)作為天然免疫防御系統的重要組成部分,在機體天然免疫防御和免疫復合物清除中發揮作用。本研究擬通過免疫組化和蛋白印跡法觀察尋常性銀屑病患者皮損、非皮損和健康對照皮膚組織中MBL的表達情況,初步探討MBL與銀屑病發病可能存在的關系。

資料與方法

一、研究對象

進行期尋常性銀屑病患者30例,男19例,女11例;年齡13～63歲,平均36.7歲,病程0.3～10年。取皮膚標本前2周內未外用糖皮質激素,3個月內未接受糖皮質激素、免疫抑制劑、生物制劑、激光治療及光化學療法。標本取自銀屑病皮損和皮損周圍外觀正常皮膚。30例健康對照皮膚來自本院美容整形科手術患者,男18例,女12例;年齡16～61歲,平均年齡33.6歲。銀屑病患者組和健康對照組性別、年齡差異均無統計學意義。本研究通過醫院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。

二、主要試劑

MBL單克隆抗體(丹麥Antibodyshop公司生產),抗β肌動蛋白抗體(上海碧云天生物有限公司),凱基全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司),免疫組化SABC試劑盒(北京康煜輝生物技術有限公司)。P0012S型(Bicinchoninic acid)蛋白濃度測定試劑盒、增強化學發光試劑盒(ECL試劑盒,美國Santa Cruz公司)。

三、實驗方法

1.免疫組化檢測:取銀屑病患者皮損、非皮損及健康對照皮膚進行MBL免疫組化檢測。切片組織行熱抗原修復;10%山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育20 min;滴加一抗(MBL稀釋滴度1∶500)工作液,4℃過夜;滴加生物素標記二抗,37℃孵育20 min;滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素,37℃孵育15 min;二氨基聯苯(DAB)顯色;后經蘇木精復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。應用ImagePro Plus6軟件測定免疫組化染色區域吸光度(A值)進行半定量分析。

2.Western印跡分析:取-80℃保存的組織塊100 mg,采用凱基全蛋白提取試劑盒進行蛋白抽提,BCA法測定蛋白質濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉移至硝酸纖維素薄膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜后加入一抗(1∶2 000 MBL抗體、1∶500 β肌動蛋白抗體),4℃過夜,PBS洗膜。然后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗鼠二抗(1∶1 250)反應液,室溫下振蕩反應。應用ECL試劑盒顯影、定影,凝膠成像系統中成像。用TotalLab1.0軟件進行各條帶相對吸光度值的半定量分析,以各目的條帶與β肌動蛋白的積分吸光度值(IOD)的比值代表其蛋白的相對表達量。

四、統計學處理

結 果

一、免疫組化檢測銀屑病患者皮損、非皮損及健康對照皮膚MBL的表達

銀屑病患者皮損、非皮損及健康對照皮膚均見MBL表達,其相對表達量分別為0.636 7±0.515 1、0.416 3±0.160 1、0.381 6±0.310 9,銀屑病患者皮損部MBL表達水平較非皮損區和健康對照皮膚顯著升高(t值分別為2.24和2.32,均P＜0.05),非皮損區與健康對照皮膚MBL表達水平間差異無統計學意義(t=1.51,P＞0.05)。見圖1。

圖1 甘露糖結合凝集素(MBL)在銀屑病皮損區及非皮損區的免疫組化染色(免疫組化×400) 1a:銀屑病非皮損區MBL表達在棘細胞層及基底層,表達較弱;1b:銀屑病皮損區MBL表達主要在基底層,表達強陽性;1c:健康對照皮膚幾乎無陽性表達

圖2 甘露糖結合凝集素(MBL)蛋白在銀屑病皮損區及非皮損區皮膚中的表達 1:銀屑病非皮損;2:銀屑病皮損;3:健康對照皮膚

二、Western印跡檢測銀屑病患者皮損、非皮損及健康對照皮膚MBL的表達

銀屑病患者皮損、非皮損及健康對照皮膚均有MBL表達,其MBL蛋白相對表達量分別為0.273 1±0.129 4、0.186 3 ± 0.193 1、0.149 2± 0.268 7, 銀屑病患者皮損部位MBL表達水平較非皮損區及健康對照皮膚顯著升高(t值分別為2.05和2.28,均P＜0.05)。非皮損區與健康對照皮膚MBL表達水平間差異無統計學意義(t=0.61,P＞0.05)。見圖2。

討 論

銀屑病患者體內存在天然免疫紊亂現象,選擇天然免疫系統中的細胞和分子成分作為靶點已成為治療銀屑病的重要手段和研究方向[4-5]。針對部分天然免疫相關因子白細胞介素12/23、腫瘤壞死因子α治療銀屑病已進入Ⅱ期臨床研究及臨床應用階段,并取得令人滿意的治療效果[4-6],提示天然免疫在銀屑病的發病過程中可能起著非常關鍵的作用。

人類甘露糖結合凝集素是天然免疫防御系統中的重要組成部分,為非酶非抗體的天然一線抗感染免疫分子,是一種鈣離子依賴性糖結合蛋白,在肝臟合成后分泌到血液中。在抗原抗體發生特異性免疫反應之前，誘導激活機體的非特異性免疫反應,現已證實MBL至少有以下4種功能:激活補體、促進調理吞噬、調節炎癥反應及促進凋亡[7-8]。如果MBL發生基因突變,導致缺損或異常,則影響機體的天然免疫能力。多項研究表明,MBL基因突變和由此引起的MBL血清水平的變化與感染性疾病、自身免疫性疾病的發生有顯著相關關系[9-12]。有學者研究MBL與系統性紅斑狼瘡的關系,結果顯示,MBL2基因多態性和低MBL血清水平與系統性紅斑狼瘡的發生及臨床癥狀的嚴重程度顯著相關[12-13]。Tao等[10]對151例呼吸道感染患兒MBL結構基因啟動子區的基因多態性、血清MBL水平與感染的關系進行研究,發現患兒血清MBL濃度明顯低于健康組,其等位基因變異頻率顯著高于健康組,且基因變異與血清MBL濃度間存在一定相關關系。2003年Jensenius等[14]首次合成了重組MBL,為開展藥物臨床實驗提供了條件。重組MBL對于感染性疾病、乳腺癌等患者的Ⅱ期臨床實驗已取得較為滿意的臨床療效[15-17]。

我們的前期研究結果顯示,銀屑病組MBL突變基因型頻率顯著高于健康對照組,銀屑病組GAC等位基因頻率增高,而銀屑病患者血清MBL水平顯著低于對照組[18]。本文進一步對銀屑病患者皮損中MBL表達的情況進行免疫組化及Western印跡檢測,結果表明,銀屑病皮損區MBL水平較非皮損區及健康對照皮膚顯著增高。因而推測銀屑病患者血清MBL水平降低除受MBL基因多態性的影響外,還可能與皮損區MBL沉積等代謝消耗有關,亦或可能有其他機制存在。我們推測,銀屑病皮損區的MBL可能通過激活補體等方式,介導炎癥介質對局部皮膚造成損傷。

Turan等[19]對50例銀屑病患者MBL基因第54號密碼子基因多態性進行研究,結果顯示,銀屑病患者MBL突變基因型GGC/GAC頻率顯著高于健康對照組,但對銀屑病皮損中MBL的表達未做探討。MBL與銀屑病發病的關系有待進一步研究。

[1]Gaspari AA.Innate and adaptive immunity and the pathophysiology of psoriasis[J].J Am Acad Dermatol，2006，54(3 Suppl 2):S67-S80.

[2]Curry JL，Qin JZ，Bonish B，et al.Innate immune-related receptors in normal and psoriatic skin[J].Arch Pathol Lab Med，2003，127(2):178-186.

[3]Killeen ME，Ferris L，Kupetsky EA，et al.Signaling through purinergic receptors for ATP induces human cutaneous innate and adaptive Th17 responses:implications in the pathogenesis of psoriasis[J].J Immunol，2013，190(8):4324-4336.

[4]Guerra I，Gisbert JP.Onset of psoriasis in patients with inflammatory bowel disease treated with anti-TNF agents[J].Expert Rev Gastroenterol Hepatol，2013，7(1):41-48.

[5]Mease P.Update on treatment of psoriatic arthritis[J].Bull NYU Hosp Jt Dis，2012，70(3):167-171.

[6]Laws PM，Young HS.Current and emerging systemic treatment strategies for psoriasis[J].Drugs，2012，72(14):1867-1880.

[7]Presanis JS，Kojima M，Sim RB.Biochemistry and genetics of mannan-binding lectin(MBL)[J].Biochem Soc Trans，2003，31(Pt 4):748-752.

[8]Turner MW.The role of mannose-binding lectin in health and disease[J].Mol Immunol，2003，40(7):423-429.

[9]Harrison E，Singh A，Morris J，et al.Mannose-binding lectin genotype and serum levels in patients with chronic and allergic pulmonary aspergillosis[J].Int J Immunogenet，2012，39(3):224-232.

[10]Tao R，Hua CZ，Hu YZ，et al.Genetic polymorphisms and serum levels of mannose-binding lectin in Chinese pediatric patients with common infectious diseases[J].Int J Infect Dis，2012，16(5):403-407.

[11]Xu WD，Peng H，Zhou M，et al.Association of RANTES and MBL gene polymorphisms with systemic lupus erythematosus:a meta-analysis[J].Mol Biol Rep，2013，40(2):941-948.

[12]Panda AK，Parida JR，Tripathy R，et al.Low producer MBL genotypes are associated with susceptibility to systemic lupus erythematosus in Odisha，India[J].Hum Immunol，2013，74(1):114-119.

[13]Hristova M，Dourmishev L，Kamenarska Z，et al.MBL2 polymorphisms-manifestations in Bulgarian Bulgaria pat adult dermatomyositis and systemic lupus erythematosus[J].Int J Immunogenet，2014，41(2):119-125.

[14]Jensenius JC，Jensen PH，McGuire K，et al.Recombinant mannanbinding lectin(MBL)for therapy[J].Biochem Soc Trans，2003，31(Pt 4):763-767.

[15]Gupta K，Gupta RK，Hajela K.Disease associations of mannosebinding lectin&potential of replacement therapy[J].Indian J Med Res，2008，127(5):431-440.

[16]Maal?e N，Bonde C，Laursen I，et al.Mannan-binding lectin and healing of a radiation-induced chronic ulcer:a case report on mannan-binding lectin replacement therapy[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg，2011，64(6):e146-e148.

[17]Chalmers JD，Fleming GB，Hill AT，et al.Impact of mannosebinding lectin insufficiency on the course of cystic fibrosis:A review and meta-analysis[J].Glycobiology，2011，21(3):271-282.

[18]蘇英，郭淑蘭，于曉靜，等.銀屑病患者甘露糖結合凝集素基因多態性及血清水平的研究[J].中華皮膚科雜志，2014，47(3):157-159.

[19]Turan H，Karkucak M，Yakut T，et al.Does MBL2 codon 54 polymorphism play a role in the pathogenesis of psoriasis?[J].Int J Dermatol，2014，53(1):34-38.

2014-03-19)

(本文編輯:顏艷)

Expression of mannose-binding lectin in lesions of psoriasis vulgaris

Su Ying，Guo Shulan，Yu Xiaojing，Li Chunyang，Sun Qing.Department of Dermatology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China

Sun Qing，Email:sywxlwjz@163.com

ObjectiveTo investigate the expression of mannose-binding lectin(MBL)in lesions of patients with psoriasis vulgaris，and to explore the relationship between MBL and psoriasis pathogenesis.MethodsImmunohistochemistry and Western blot were performed to detect the expression of MBL in lesional and normalappearing perilesional skin of 30 patients with progressive psoriasis vulgaris，as well as in normal skin of 30 healthy human controls.Statistical analysis was carried out byttest using SPSS13.0 software.ResultsImmunohistochemistry showed that MBL was expressed in lesional psoriatic skin，but weakly expressed or absent in normalappearing perilesional skin and normal control skin，with the relative expression level of MBL in lesional skin significantly higher than that in perilesional skin and normal control skin(0.636 7±0.515 1 vs.0.416 3±0.160 1 and 0.381 6 ± 0.310 9，t=2.24，2.32，respectively，bothP＜ 0.05).Western blot revealed a positive expression of MBL protein in all the skin specimens，and the expression intensity of MBL protein in lesional psoriatic skin was significantly increased compared with perilesional psoriatic skin and normal control skin(0.273 1±0.129 4 vs.0.186 3 ± 0.193 1 and 0.149 2 ± 0.268 7，t=2.05，2.28，respectively，bothP＜ 0.05).No significant difference was shown in the expression of MBL protein between perilesional psoriatic skin and normal control skin by immunohistochemistry(t=1.51，P＞ 0.05)or Western blot(t=0.61，P＞ 0.05).ConclusionThere is a high expression of MBL protein in lesions of patients with psoriasis vulgaris，which may be somewhat associated with the pathogenesis of psoriasis.

Psoriasis;Mannose-binding lectins;Immunity，natural

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.001

國家自然科學基金青年基金(30901295);山東省自然科學基金(Y2007C033)

250012濟南，山東大學齊魯醫院皮膚科

孫青,Email:sywxlwjz@163.com