反轉錄病毒載體介導的P27kip1促HepG2細胞凋亡

潘永平，龔 輝，邱夢標，樊曉慧，毛紅霞，熊水印，粟慶娟

(南昌大學第四附屬醫院感染科，江西南昌330003)

肝細胞癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，癌細胞的生物學特征是多種原癌基因的激活、抑癌基因的失活及一系列復雜的調控機制失常所致的生長失控。其主要分子機制是細胞周期紊亂和凋亡過少。P27kip1是一種細胞周期素依賴性激酶抑制劑，可將細胞阻滯于G1期，并誘導細胞凋亡，已經發現P27kip1在多種腫瘤組織中表達量降低［1］，且在腫瘤細胞中，P27kip1減少的程度與細胞DNA損傷的程度有一定的關系［2］。因此，P27kip1途徑可能成為腫瘤診斷［3］和治療的新的靶點。

為了研究肝癌細胞中的P27kip1的表達情況，并考查外源導入P27kip1對肝癌細胞的影響，為基于P27kip1的腫瘤治療研究提供理論依據，本實驗構建了載有P27kip1基因的反轉錄病毒載體，篩選出了可穩定產生病毒的PA317包裝細胞，構建了過表達P27kip1的 HepG2細胞，并檢測了過表達 P27kip1對HepG2細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

pLNCX質粒、攜帶有人 P27kip1基因的 pUC18-P27質粒、DH5α菌種、PA317細胞、HepG2細胞由本實驗室提供。質粒提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)。HindⅢ、ClaⅠ限制性內切酶、Taq酶(Promega公司)，DMEM、FCS、胰蛋白酶、Lipofectamine-2000轉染試劑盒、G418(Gibco公司)。鼠抗人P27kip1抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 構建p LNCX-P27質粒

分別用HindⅢ及ClaⅠ酶切pUC18-P27質粒及pLNCX質粒，用T4連接酶將兩者定向連接，轉化DH5α感受態細菌，提取 pLNCX-p27質粒，經HindⅢ及ClaⅠ雙酶切鑒定。

1.3 轉染PA317細胞

采用脂質體介導法將15μL的重組pLNCX-p27質粒轉染反轉錄病毒包裝細胞 PA317，同時以空pLNCX載體作為對照組。轉染48 h后，胰蛋白酶消化細胞，培養液中加入300μg/L G418進行篩選，每3～4 d換液1次，G418濃度逐漸增加至500μg/L，3周后獲得穩定轉染克隆。……