PBDC1蛋白的表達及其多克隆抗體的制備

戚武林，胡江江，曹玲玲，趙輔昆，張世馥

(浙江理工大學生命科學學院蛋白質組學與分子酶學研究室，浙江杭州310018)

多糖生物合成域1蛋白(polysaccharide biosynthesis domain-containing 1，PBDC1)含有198個氨基酸，分子質量約為22.2 ku。在丁酸鈉(sodium butyrate，SB)［1－2］誘導小鼠紅白血病(murine erythroleukemia，MEL)細胞［3］分化的差異蛋白質組中，發現了PBDC1蛋白含量在細胞紅系分化過程中逐漸下調。由此推測，PBDC1蛋白可能與誘導的MEL細胞分化有關。鎳柱親和層析的原理是利用蛋白質表面的組氨酸能與Ni2+發生特殊的相互作用，能夠吸附富含組氨酸的蛋白質，從而達到分離純化的目的。本實驗擬通過原核表達系統表達含有6×His標簽的PBDC1融合蛋白，通過鎳離子親和柱純化得到PBDC1融合蛋白，并免疫新西蘭大白兔制備其多克隆抗體，為研究PBDC1蛋白在紅系分化中的功能提供有利工具。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌E．coli BL21(DE3)和pET-28a(+)質粒(本研究室保存);MEL細胞(上海生命科學研究院);DMEM培養基和胎牛血清(Gibco公司);質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒(Qiagen公司);DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ和 XhoⅠ(Takara公司);異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、弗氏完全佐劑與不完全佐劑(Sigma公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);反轉錄試劑盒(Fermentas公司);鎳離子親和層析介質(上海生工生物工程公司);其他試劑均為分析純;引物合成、DNA測序(上海桑尼生物科技有限公司);質譜鑒定(本研究室完成);免疫用新西蘭大白兔為普通級，體質量約2.5 kg，雄性，來源于浙江省實驗動物中心［合格證號SCXK(浙)2009-0039］。

1.2 PBDC1基因的獲得

MEL細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養至對數增殖期，收集細胞，提取RNA［4］，反轉錄獲得cDNA。根據PBDC1基因序列，設計上……