自噬抑制劑促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞凋亡

王路喬，黃 波，黃茶花，王 伶，程曉曙*

自噬(autophagy)是將細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及受損細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行消化降解的過程，是一種廣泛存在的正常生理過程和防御機(jī)制。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)心肌缺血缺氧都能誘發(fā)細(xì)胞自噬發(fā)揮心肌保護(hù)作用［1－2］。然而，缺氧過程誘發(fā)自噬增強(qiáng)是否能通過下調(diào)促凋亡蛋白Bim和caspase-3表達(dá)，抑制凋亡從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用呢?目前這一機(jī)制還不十分明確。另外，近年來研究證實(shí)缺氧或缺血過程中自噬的誘導(dǎo)激活涉及到低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)的調(diào)控［3］，那么缺氧過程自噬的心肌保護(hù)作用是否與HIF-1的調(diào)控有關(guān)呢?

1 材料與方法

1.1 SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)

新生1～3 d Spradgue-Dawley乳鼠(南昌大學(xué)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)部)，75%乙醇浸泡數(shù)秒后，取出心臟剝除心外膜及多余組織，剪成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm大小的組織塊，0.08%胰蛋白酶和10%膠原酶37℃ CO2培養(yǎng)箱中消化2 h，離心重懸細(xì)胞，200目濾網(wǎng)過濾后差速貼壁2 h，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中。24 h后第1次換液，一般培養(yǎng)至第4天時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前給細(xì)胞換液。

1.2 缺氧模型建立及分組

將原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞置于缺氧盒中通入含95%N2，5%CO2的混合氣體30 min驅(qū)除缺氧小盒中的空氣后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中，分別缺氧0、2、4、8、14和24 h，取LC3-Ⅱ/Ⅰ(自噬標(biāo)志物)表達(dá)顯著增高時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，缺氧前1 h加入終濃度為10 mmol/L的3MA預(yù)處理心肌細(xì)胞抑制自噬過程，即缺氧+3MA(anoxia+3MA)組，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組(control)和單純?nèi)毖踅M(anoxia)。

1.3 藥物及試劑

3-甲基腺嘌呤(3MA)(Sigma公司)。兔來源Bim(Cell singaling公司)，caspase-3(Santa Cruz公司)，HIF-1(Proteintech 公司)，兔抗鼠的 β-actin，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(中杉金橋生物公司)，化學(xué)發(fā)光劑(Thermo Scientific公司)。……