蛋白酶體抑制劑MG132減輕糖尿病大鼠腎小管間質纖維化

王圓圓，劉麗榮，李 霜，郭 兵，石 磊，石明雋，肖 瑛

在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發生發展過程中，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)激活其下游的 Smad2/3，導致其目的基因的轉錄活化，促進腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)向間質細胞轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)及細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的合成和過度沉積，造成廣泛的腎組織纖維化［1－5］。Smad7 作為抑制性Smad蛋白，可抑制 TGF-β1/Smads信號通路致纖維化效應［1，6］。然而在 DN 進程中，Smad7蛋白的表達是顯著下調的，其機制可能與Smad泛素化調節因子2(Smad ubiquitin regulatory factor 2，Smurf2)介導的泛素化降解有關［1，7］。蛋白酶體抑制劑 MG132能對抗糖尿病介導的腎損傷［8－10］，但其抑制腎小管-間質纖維化的機制尚不甚清楚。本研究旨在觀察DM大鼠腎組織Smurf2、Smad7蛋白及纖維化相關指標的表達變化，并用MG132處理RTECs后高糖培養，觀察對 Smad7和 Smurf2及EMT和ECM相關指標的影響，探討MG132治療腎小管-間質纖維化的機制，為MG132治療DN提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)和MG132(Sigma公司);胎牛血清(Gibco Introvagen公司)、低糖DMEM培養液(Hyclone公司);Rabbit-anti-SMAd7、Rabbit-anti-角 蛋 白 18(Cytokeratin-18，CK-18)、Mouse-anti-α-平滑肌肌動蛋白(α-sooth muscle actin，α-SMA)、Rabbit-anti-纖 連 蛋 白 (fibronectin，FN)和 Rabbit-anti-膠 原 蛋 白 Ⅰ(CollagenⅠ，Col-Ⅰ)多克隆抗體(博奧森生物技術有限公司)，Mouse-anti-β-actin單克隆抗體和DAB顯色劑(博士德生物技術有限公司)，Rabbit-anti-Smurf2(1∶600)(Abcam 公司)、Rabbit-anti-鈣黏蛋白(E-cadherin)(Santa Cruz公司);兩步法免疫組化檢測試劑(中杉金橋生物技術有限公司);Western印跡用PVDF膜;Goat-anti-Rabbit FITC、Goat-anti-Mouse Tex-red、4，6-二氨基-2-苯基吲哚(4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI);超敏 ECL化學發光試劑盒(碧云天生物研究所);其他試劑均為市售分析純;RERCs(NRK-52E細胞)由上海復旦大學陸利民教授惠贈。

1.2 方法

實驗動物及糖尿病模型的制備:清潔級雄性SD大鼠20只，體質量(180±20)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，批號:SCXK(京)2009-0004。適應性飼養1周后，乙醚麻醉后尾靜脈按55 mg/kg注射0.01 mol/L無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)的鏈脲菌素。……