Tiam1-Rac1在乳腺癌組織中的表達及意義

何雄斌，方 力，胡雄強，吳海燕

(郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州423000)

近年來有關(guān)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的作用機制及抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子靶標成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(Tiam1)和Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(Rac1)均與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但對二者的相關(guān)性及其在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中共同的臨床意義國內(nèi)外研究鮮見報道。為此，我們進行了如下研究。

1 材料和方法

1.1 材料 2012年1月～2013年8月郴州市第一人民醫(yī)院病理科保存的97例份乳腺癌手術(shù)切除的石蠟包埋標本(乳腺癌組)，均經(jīng)組織病理學確診(患者均為女性，年齡28～72歲，平均45歲;術(shù)前均未行化療、放療、內(nèi)分泌治療;腫瘤直徑≤2 cm者42例，＞2 cm者55例)。病理類型:浸潤性導(dǎo)管癌78例，浸潤性小葉癌12例，髓樣癌4例，黏液癌3例。病理分級:Ⅰ級16例，Ⅱ級52例，Ⅲ級29例;臨床分期:Ⅰ期19例、Ⅱ期43例、Ⅲ期35例;伴腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者48例。另收集同期正常乳腺組織標本20份(正常組)，乳腺增生標本20份(增生組)。主要試劑:Tiam1兔抗人多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，工作濃度1∶100;兔抗人 Rac1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，工作濃度1∶800。即用型非生物素免疫組化EliVisionTMplus免疫組化檢測試劑盒，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司;DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Tiam1及Rac1表達檢測 標本經(jīng)4%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，石蠟標本連續(xù)切片3張，切片厚度為4 μm，一張行常規(guī)HE染色，另兩張分別行Tiam1、Rac1免疫組化染色，65℃烤片7 h以上后行免疫組化染色，按試劑盒說明書操作，以PBS代替一抗的乳腺癌組織免疫組化染色結(jié)果為陰性對照。Tiam1和Rac1蛋白陽性染色為在細胞膜和細胞質(zhì)中呈現(xiàn)黃色或棕色顆粒，境界清楚，無明顯背景染色。評估標準［1］:①按染色強度計分:無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分;②按陽性染色細胞百分率計分:高倍鏡下每張切片選擇10個有代表性的視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，共計數(shù)1 000個細胞。陽性細胞數(shù)＜10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。①、②計分的乘積為0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，大于5分為強陽性(+++)。最終結(jié)果由2位病理醫(yī)師采用用雙盲法判定。

1.2.2 相關(guān)性分析 分析Tiam1和Rac1表達與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系、Tiam1和Rac1表達強度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及Tiam1與Rac1表達的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS13.0分析軟件。免疫組化數(shù)據(jù)采用χ2檢驗及四格表確切概率法，相關(guān)性采用Spear-man等級相關(guān)分析。檢驗水準α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 Tiam1及 Rac1表達 乳腺癌組 Tiam1/Rac1蛋白染色呈淡黃、棕黃或黃褐色陽性顆粒，顏色濃淡不一，不均一分布于癌細胞的胞膜及胞質(zhì)中;Tiam1以胞質(zhì)表達為主，胞膜表達不明顯。正常組Tiam1和Rac1蛋白陽性率分別為40%、46% ，增生組分別為35%、30%，乳腺癌組分別為 76.3%、79.4%，乳腺癌組均明顯高于另兩組(P均＜0.01)。

2.2 Tiam1和Rac1表達與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Tiam1和Rac1表達與乳腺癌患者年齡、腫瘤大小、病理類型無關(guān)，與腫瘤分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。見表1。

表1 Tiam和Rac1表達與乳腺癌病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 相關(guān)性分析 Tiam1與Rac1在乳腺癌組織中的表達呈明顯正相關(guān)(r=0.247，P=0.012)，見表2。乳腺癌組Tiam1和Rac1蛋白均陽性者63例，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為65.08%(41/63);Tiam1和Rac1蛋白同時陰性者9例，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為11.1%(1/9)，二者比較P＜0.05。隨Tiam1和Rac1蛋白染色陽性強度的逐漸增強，乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率呈現(xiàn)出逐漸增高的趨勢，組間比較差異有統(tǒng)計學意義，見表3。

表2 乳腺癌組Tiam1和Rac1蛋白表達的關(guān)系(例)

表3 Tiam1和Rac1表達強度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率的關(guān)系

3 討論

Tiam1基因由荷蘭癌癥研究所Habets等首先由BW5147小鼠T淋巴瘤細胞高侵襲變異株中鑒定出來，定位于染色體21q22.1，其所編碼的蛋白質(zhì)是目前公認的一種普遍存在的二磷酸鳥嘌呤核苷酸(GDP)與三磷酸鳥嘌呤核苷酸(GTP)轉(zhuǎn)換因子(GEF)，屬于 Dbl(diffuse B-cell lymphoma oncogenefamily)家族成員之一，是Ras超家族的催化劑。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Tiam1在多種腫瘤細胞系中均明顯高表達，并在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。關(guān)于其在乳腺癌組織中的表達國內(nèi)外也有相似報道，Adam等［2］采用蛋白免疫印跡法研究發(fā)現(xiàn)，Tiam1在乳腺癌瘤組織中呈過度表達，腫瘤組織分級為Ⅲ級者表達水平明顯高于Ⅱ級者，表明Tiam1的表達與乳腺癌的惡性程度密切相關(guān)，吳元清等［3］檢測了126例乳腺癌組織中Tiam1的表達情況，也發(fā)現(xiàn)Tiam1與乳腺癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)Tiam1在乳腺癌組織中表達明顯高于正常乳腺組織及乳腺增生組織，且Tiam1表達與乳腺癌的組織分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān);與文獻報道結(jié)果相符。

Rac1屬Rac亞家族，定位于染色體7q22，是Rho蛋白家族中的重要成員，具有與Ras相似的作用，其蛋白全稱為Ras相關(guān)的肉毒素底物1，存在失活和激活兩種狀態(tài)，并與細胞移動的關(guān)系密切。Rac1的激活可引起一系列下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，如JNK激酶(c-jun N-terminal kinase)、p38蛋白激酶、MAPK(絲裂素活化蛋白激酶)等在細胞骨架重組，細胞黏附與運動，基因表達調(diào)控，甚至惡性腫瘤的形成、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［4，5］。研究顯示在各種細胞外信號刺激下 Tiaml可以特異性地激活Racl，并通過Tiaml/Racl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活其下游的一系列的信號分子從面發(fā)揮重要的生物學功能。鐘大平等［6］在研究Tiam1和Rac1在大腸癌中的表達時發(fā)現(xiàn)，二者在基因和蛋白水平均呈明顯正相關(guān)，并與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和Duke分期相關(guān)。國內(nèi)眾多學者也在卵巢癌［7］、肺癌、胃癌［8］、食管鱗癌［9］、宮頸鱗癌［10］及骨肉瘤［11］等惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，Tiam1與Rac1表達呈明確的正相關(guān)，還與惡性腫瘤的浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺組織及乳腺增生組織相比Rac1在乳腺癌組織中呈高表達，其表達與乳腺癌的組織分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也顯著相關(guān);二者在乳腺癌的表達中也呈明顯的正相關(guān)。為進一步明確二者的關(guān)系，我們比較了Tiam1和Rac1均陽性癌患與均陰性的乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，結(jié)果顯示Tiam1和Rac1均陽性者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯高于均陰性者，提示Tiam1和Rac1蛋白在乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中具有協(xié)同作用。本研究我們還意外發(fā)現(xiàn)隨著乳腺癌Tiam1和Rac1蛋白染色強度的增強，乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率也呈逐漸升高的趨勢。

綜上所述，Tiam1和Rac1在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，聯(lián)合檢測Tiam1和Rac1在乳腺癌組織中的表達情況及其陽性強度，對于預(yù)測乳腺癌的預(yù)后，尤其是乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移具有重要的指導(dǎo)意義。

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