心腦欣膠囊對(duì)慢性抑郁大鼠的作用研究

楊水金 ，于海洋 ，陳文嬌 ，張國(guó)清 ，鄒存生 ，馬俊倉(cāng)，吳留強(qiáng)，夏 彬，馬世平*

1中國(guó)藥科大學(xué)中藥藥理學(xué)教研室，南京 211198；2三普藥業(yè)股份有限公司，西寧 214257

隨著人們生活工作節(jié)奏的加快，抑郁癥的發(fā)病率日趨增加。有學(xué)者預(yù)計(jì)本病將成為21世紀(jì)繼心血管疾病之后的第二大危害人類健康的疾病[1]。抗抑郁藥應(yīng)用于臨床已經(jīng)有數(shù)十年，但由于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，針對(duì)某單一環(huán)節(jié)的藥物往往難以取得滿意療效。合成抗抑郁藥大多存在抗抑郁譜窄、副作用大和易復(fù)發(fā)等缺陷。因此，國(guó)內(nèi)外在抗抑郁藥的研制與開(kāi)發(fā)方面越來(lái)越注重傳統(tǒng)藥，尤其是有兩千多年歷史的中草藥。

心腦欣膠囊是以藏藥紅景天為主要原料，輔以沙棘、枸杞提取物而制成的復(fù)方制劑，具有益氣養(yǎng)陰、活血化痰的作用。臨床報(bào)道心腦欣膠囊能減輕氟西汀的不良反應(yīng)，提高高原地區(qū)老年抑郁癥患者對(duì)抗抑郁藥的耐受性、依從性，治療效果好、不良反應(yīng)少，是適合治療高原地區(qū)老年抑郁癥的理想藥物[2]。紅景天為該方君藥，具有補(bǔ)氣清肺、益智養(yǎng)心、收澀止血、散瘀消腫之功效。現(xiàn)代藥理研究顯示其具有抗缺氧，抗疲勞，延緩衰老，對(duì)中樞神經(jīng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)的雙向調(diào)節(jié)等多種活性，臨床應(yīng)用于提高大腦功能、神經(jīng)官能癥、張力減退綜合征和高原反應(yīng)等病癥[3-4]。本實(shí)驗(yàn)研究心腦欣膠囊對(duì)慢性不可預(yù)知應(yīng)激抑郁模型大鼠的抗抑郁作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材 料

1.1 藥物和試劑

心腦欣膠囊，內(nèi)容物為棕褐色粉末，0.5 g/粒，批號(hào)：120803，三普藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)時(shí)，去除膠囊外殼，研磨內(nèi)容物，用雙蒸水配置成所需濃度。鹽酸氟西汀片，批號(hào)：BJ09103，常州四藥制藥有限公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)時(shí)，研磨為粉末，用雙蒸水配置成所需濃度。

NO（批號(hào) 20130426）、iNOS（批號(hào) 20130529）、MAO測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；二氯甲烷、濃硫酸、無(wú)水乙醇均為化學(xué)純；硫酸乙醇呈色液:量取7份分析純濃硫酸和3份分析純無(wú)水乙醇混合；0.04 mol·L-1NaOH 溶液。

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體重180～220 g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2012-0004。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，保持12 h晝夜節(jié)律，室溫22±1℃，自由飲水?dāng)z食。

2 方法與結(jié)果

2.1 動(dòng)物造模、分組及給藥

雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為空白組（給予蒸餾水），模型組（給予蒸餾水），鹽酸氟西汀組（10 mg·kg-1）和心腦欣膠囊低（100 mg·kg-1）、中（200 mg·kg-1）、高（400 mg·kg-1）劑量組。除空白組大鼠，每天灌胃給予蒸餾水，不接受任何刺激外，其余各組大鼠每天隨機(jī)給予不同刺激。應(yīng)激方式包括：冷水游泳（10°C，6 min）、晝夜顛倒（24 h）、接觸異物（24 h）、禁食（24 h）、禁水（24 h）、水平搖晃（1 次/s，10 min）、噪音（10 min）和 45°傾斜鼠籠（24 h）共 8種刺激方式，每天隨機(jī)安排1～2種刺激，平均每種刺激各3次。連續(xù)造模和給藥21 d，各組每日上午9時(shí)灌胃，每日一次，給藥體積均為0.1 mL/10 g。

2.2 開(kāi)野實(shí)驗(yàn)

各組大鼠于末次給藥后1 h用1.22 m2×45 cm高的敞箱（4×4方格）測(cè)定各組大鼠6 min行為學(xué)的改變。比較正常大鼠、慢性應(yīng)激大鼠和給予心腦欣膠囊和鹽酸氟西汀的大鼠在后3 min內(nèi)自發(fā)活動(dòng)的差異，觀察指標(biāo)包括：（1）水平穿格次數(shù)（行走路線與格子交叉點(diǎn)數(shù)）；（2）直立次數(shù)（大鼠兩前爪騰空或攀附箱壁次數(shù)）。行為評(píng)定采用單盲法，觀察慢性應(yīng)激及藥物對(duì)大鼠自發(fā)活動(dòng)能力的影響。

結(jié)果顯示，與空白組大鼠比較，模型組大鼠自發(fā)活動(dòng)能力明顯降低，表現(xiàn)為穿格次數(shù)、直立次數(shù)明顯減少；給予心腦欣膠囊后，與模型組相比，大鼠的穿格次數(shù)、直立次數(shù)明顯增加；鹽酸氟西汀組組表現(xiàn)出相同的作用。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 心腦欣膠囊對(duì)慢性抑郁模型大鼠糖水偏好率、強(qiáng)迫游泳和懸尾不動(dòng)時(shí)間、開(kāi)野實(shí)驗(yàn)的影響（±s，n=10）

表1 心腦欣膠囊對(duì)慢性抑郁模型大鼠糖水偏好率、強(qiáng)迫游泳和懸尾不動(dòng)時(shí)間、開(kāi)野實(shí)驗(yàn)的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較：△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量（mg·kg-1） 糖水偏好率（%） 游泳不動(dòng)時(shí)間（s） 懸尾不動(dòng)時(shí)間（s） 開(kāi)野實(shí)驗(yàn)穿格次數(shù) 直立次數(shù)空白組模型組氟西汀組心腦欣膠囊組心腦欣膠囊組心腦欣膠囊組——1 0 100 200 400 89.41±8.89 49.60±10.37△△92.10±2.60**88.28±13.93**82.71±18.05**89.35±6.13**62.5±20.60 91.40±21.18△△38.38±11.33**56.70±15.20*48.40±13.30*48.00±13.70*90.00±21.40 159.00±24.10△△50.50±17.81*156.33±12.10 149.43±28.57 129.30±16.09*35.33±11.92 4.67±1.75△△21.75±5.31**20.80±6.49**19.29±7.29*21.00±5.93**8.50±3.33 1.50±1.22△△4.67±1.63**5.83±1.60*7.17±2.56**10.25±2.36**

2.3 糖水消耗實(shí)驗(yàn)

各組大鼠于末次給藥后1 h分別測(cè)定各組大鼠的糖水消耗量（sucrose intake）。參照文獻(xiàn)方法[5-6]，每籠同時(shí)放置2個(gè)水瓶，第1個(gè)24 h 2瓶均裝有1%（w/v）蔗糖水，隨后 24 h，1 瓶 1%蔗糖水，1 瓶純水。之后禁食禁水12 h后大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，給予1瓶1%蔗糖水、1瓶純水，測(cè)定12 h（中途6 h時(shí)交換瓶子位置）各組大鼠的糖水、純水以及總液體的消耗量。比較各組大鼠在糖水消耗及糖水偏好方面的差異。糖水偏好（sucrose preference，SP）以蔗糖水溶液的消耗量（g）/總液體的消耗量（g）×100%表示。

結(jié)果顯示，與空白組大鼠比較，模型組大鼠糖水偏好明顯降低（△△P＜0.01），出現(xiàn)快感缺乏癥狀；與模型組相比，給予心腦欣膠囊后可顯著增加大鼠糖水偏好；鹽酸氟西汀組表現(xiàn)出相同的作用。表明心腦欣膠囊可改善慢性抑郁大鼠的情緒，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 懸尾實(shí)驗(yàn)

各組大鼠于末次給藥后1 h進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)。參照Steru等[8]的方法，將大鼠尾端4 cm的部位貼在一根水平木棍上，使動(dòng)物成倒掛狀態(tài)，其頭部離臺(tái)面約15 cm，用板隔開(kāi)相鄰動(dòng)物的視線。判斷標(biāo)準(zhǔn)：大鼠被動(dòng)懸掛期間，無(wú)任何活動(dòng)時(shí)，定為不動(dòng)狀態(tài)。觀察6 min，比較各組大鼠在后4 min內(nèi)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。

結(jié)果顯示，與空白組大鼠比較，模型組大鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間明顯增加（△△P＜0.01）；與模型組相比，心腦欣膠囊高劑量組可顯著降低大鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間（*P＜0.05）； 鹽酸氟西汀組表現(xiàn)出相同的作用 （△P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

各組大鼠于末次給藥后1 h進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。參照Porsolt等[7]方法，將大鼠置于水深30 cm、水溫25°C的玻璃圓筒（50 cm高，25 cm直徑）中，觀察6 min，比較各組大鼠在后4 min內(nèi)的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)時(shí)間判定：大鼠漂浮在水面，不努力爬出圓筒，僅做一些必須保持其頭部在水面的動(dòng)作。

結(jié)果顯示，與空白組大鼠比較，模型組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間明顯增加（△△P＜0.01）；與模型組相比，鹽酸氟西汀組與心腦欣各劑量組均可顯著降低大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 大鼠血清皮質(zhì)酮含量的測(cè)定

大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后1 h，股動(dòng)脈取血處死，分離血清。采用熒光法測(cè)定，參照Frankel等[9]的方法取0.50 mL， 加入0.50 mL 0.04 mol·L-1NaOH溶液，充分混勻后置60 mL分液漏斗中，加5 mL二氯甲烷充分振蕩2 min，靜置分層后，棄水相，用10 mL試管收集二氯甲烷，加入2.5 mL硫酸乙醇（7∶3）呈色液，充分搖勻2 min后靜置30 min，小心用細(xì)頭吸管將二氯甲烷層吸去，呈色液靜置30 min后在熒光分光光度計(jì)上，激發(fā)波長(zhǎng)470 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm（激發(fā)波長(zhǎng)狹縫10 nm，發(fā)射波長(zhǎng)狹縫20 nm）處測(cè)定熒光值。

結(jié)果顯示，與空白組大鼠比較，模型組大鼠血清皮質(zhì)酮含量明顯增加（△△P＜0.01）；與模型組相比，心腦欣膠囊中低劑量組可顯著降低大鼠血清皮質(zhì)酮含量（*P＜0.05）；鹽酸氟西汀組表現(xiàn)出相同的作用（△△P＜0.01）。 結(jié)果見(jiàn)表 2。 皮質(zhì)酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.328X+0.0038，r2=0.997

表2 心腦欣膠囊對(duì)慢性抑郁模型大鼠海馬MAO、iNOS、NO含量及血清皮質(zhì)酮含量的影響（±s，n=10）

表2 心腦欣膠囊對(duì)慢性抑郁模型大鼠海馬MAO、iNOS、NO含量及血清皮質(zhì)酮含量的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較：△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白組模型組氟西汀組心腦欣膠囊組心腦欣膠囊組心腦欣膠囊組劑量（mg·kg-1）——1 0 100 200 400 MAO（U·mgprot-1）4.90±0.24 7.94±0.57△△4.64±0.17**4.48±0.36**4.67±0.37**3.65±0.28**iNOS（U·mgprot-1）0.73±0.19 1.4±0.56△0.77±0.19*0.88±0.28**0.92±0.20**1.03±0.43*NO（μmol·gprot-1）2.48±0.45 7.86±0.68△△2.33±0.26**3.65±0.26**2.78±0.27**2.65±0.34*皮質(zhì)酮（μg·mL-1）0.29±0.09 0.67±0.07△△0.34±0.08**0.61±0.12*0.59±0.10*0.64±0.11

2.7 大鼠海馬組織MAO活力測(cè)定

大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后1 h處死，冰臺(tái)上迅速分離海馬，準(zhǔn)確稱得重量，按重量體積比加入生理鹽水制成10%的組織勻漿，3000 r·min-1離心10 min，取組織勻漿上清液進(jìn)行測(cè)定。按照MAO試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作；BCA測(cè)定法測(cè)定組織中的蛋白含量。

結(jié)果顯示，與空白組大鼠比較，模型組大鼠腦組織 MAO 活力明顯升高（△△P＜0.01）；與模型組相比，鹽酸氟西汀組與心腦欣膠囊各劑量組均可顯著降低大鼠腦組織MAO的活力。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.8 大鼠海馬組織iNOS測(cè)定

取腦，冰臺(tái)上迅速分離雙側(cè)海馬，準(zhǔn)確稱得重量，冰浴中按重量體積比加入生理鹽水制成10%的組織勻漿，3000 r·min-1離心10 min，取組織勻漿上清液進(jìn)行測(cè)定。按照iNOS試劑盒說(shuō)明書操作，參考BCA測(cè)定法測(cè)定組織中的蛋白含量。

結(jié)果顯示，與空白組大鼠比較，模型組大鼠腦組織iNOS活力明顯升高 （△P＜0.05）；與模型組相比，心腦欣膠囊可顯著降低大鼠腦組織iNOS的活力（*P＜0.05）。 結(jié)果見(jiàn)表 2。

2.9 大鼠海馬組織NO含量的測(cè)定

取腦，冰臺(tái)上迅速分離雙側(cè)海馬組織，稱重，冰浴中按重量體積比加入生理鹽水制成10%的組織勻漿，3000 r·min-1離心10 min，取組織勻漿上清液進(jìn)行測(cè)定。按照NO試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定含量（硝酸還原酶法）。試劑配制按說(shuō)明進(jìn)行，取10%的勻漿液稀釋9倍，配成1%的組織勻漿液。量取0.5 mL與試劑混勻，37℃水浴60 min，充分渦旋混勻30 s，室溫靜置 10 min，3000 r·min-1離心 10 min，取上清液。蒸餾水調(diào)零，紫外分光光度計(jì)測(cè)定各管吸光度值。

結(jié)果顯示，與空白組大鼠比較，模型組大鼠腦組織NO含量明顯升高（△△P＜0.01）；與模型組相比，心腦欣膠囊可顯著降低大鼠腦組織NO含量 （**P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 討 論

不可預(yù)知慢性應(yīng)激抑郁模型，是將多種不同的應(yīng)激因子依次隨機(jī)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)用，特點(diǎn)是應(yīng)激因子的多變性和不可預(yù)測(cè)性，其模擬行為學(xué)以及神經(jīng)內(nèi)分泌等變化與人類抑郁癥相類似，已成為國(guó)內(nèi)外研究抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及抗抑郁藥物作用機(jī)制而廣泛應(yīng)用的動(dòng)物模型之一[10-11]。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法，利用慢性不可預(yù)知中等強(qiáng)度應(yīng)激刺激進(jìn)行造模。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠水平穿格次數(shù)、直立次數(shù)明顯減少，糖水消耗量明顯降低，強(qiáng)迫游泳和懸尾不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，表明該模型大鼠在行為學(xué)上表現(xiàn)為活動(dòng)度、對(duì)新鮮周圍環(huán)境的好奇度以及對(duì)獎(jiǎng)賞反應(yīng)均顯著下降，表明不可預(yù)知慢性應(yīng)激模型造模成功。而通過(guò)連續(xù)21 d給予心腦欣膠囊可顯著逆轉(zhuǎn)這一行為學(xué)異常改變，提示心腦欣膠囊具有較強(qiáng)的抗抑郁作用。

抑郁癥的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，可能與慢性應(yīng)激刺激導(dǎo)致的海馬結(jié)構(gòu)功能損傷有關(guān)，而下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸在機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，下丘腦室旁核（paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN）小細(xì)胞神經(jīng)元分泌促腎上腺皮質(zhì)激 素 釋 放 激 素 （corticotropin releasing hormone，CRH），進(jìn)而刺激垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH），ACTH 經(jīng)血循環(huán)達(dá)腎上腺，促使應(yīng)激激素糖皮質(zhì)類固醇（glucocorticoid，GC）分泌增多，從而動(dòng)員儲(chǔ)能,適應(yīng)應(yīng)激反應(yīng)，有利于機(jī)體度過(guò)短期惡劣環(huán)境。另外，海馬富含糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR），且是中樞GR含量最多的腦區(qū)[12]，海馬可通過(guò)GR抑制應(yīng)激過(guò)程中激活的HPA軸，使之恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。但長(zhǎng)期慢性應(yīng)激刺激能夠持續(xù)激活HPA軸，導(dǎo)致GC水平持續(xù)升高，過(guò)量GC極易造成富含GR的海馬受損，從而減弱海馬對(duì)HPA軸的抑制作用，進(jìn)一步加重HPA軸的亢進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)21天不可預(yù)知的慢性應(yīng)激，模型大鼠血清皮質(zhì)酮含量顯著升高，而心腦欣膠囊中、低劑量組可以顯著降低應(yīng)激大鼠血清皮質(zhì)酮水平,提示心腦欣膠囊可以抑制應(yīng)激過(guò)程HPA軸的過(guò)度激活，降低血清皮質(zhì)酮含量。

也有研究表明，抑郁癥的發(fā)生與活性氮自由基引起的神經(jīng)元死亡密切相關(guān)。NO作為細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間非典型的神經(jīng)信使，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起到雙重作用，生理濃度的NO起到信號(hào)分子的作用，可導(dǎo)向軸突生長(zhǎng)，參與突觸重塑，起到調(diào)控、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[13-14]；但高濃度NO則具有神經(jīng)細(xì)胞毒性，引起細(xì)胞代謝及功能障礙，對(duì)細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。NO在體內(nèi)由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸產(chǎn)生NO[16]。NOS包括三種同工酶，即誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、神經(jīng)元性一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS），目前認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度表達(dá)iNOS是造成神經(jīng)元損傷的重要原因[17-18]。有研究表明，由iNOS合成的過(guò)量的NO能升高caspase-3活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；過(guò)量的NO也能通過(guò)改變線粒體結(jié)構(gòu)和功能，干擾能量代謝誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；NO還能通過(guò)激活p53作用于Bax引起細(xì)胞凋亡[19]，而抑制iNOS的表達(dá)就能相應(yīng)的減少凋亡的發(fā)生[20-21]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還證明，iNOS抑制劑L-硝基-精氨酸甲酯可減輕海馬內(nèi)注射N-methyl-D-aspartic acid（NMDA）引起的神經(jīng)損害[22]，均提示NO對(duì)海馬的毒性。本實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)21天的慢性應(yīng)激顯著激活大鼠海馬組織iNOS活性并增加NO的含量；而在慢性應(yīng)激同時(shí)給予心腦欣膠囊大鼠的海馬組織NO含量及iNOS活性明顯降低。提示心腦欣膠囊可能通過(guò)抑制iNOS的活性，降低NO水平，抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗抑郁作用。

此外，本實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，心腦欣膠囊可顯著降低應(yīng)激大鼠海馬組織中MAO的活性，提示心腦欣膠囊可能通過(guò)抑制MAO的活性進(jìn)而提高中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上所述，心腦欣膠囊對(duì)慢性不可預(yù)知應(yīng)激抑郁模型動(dòng)物具有明顯的抗抑郁作用,其機(jī)制可能與抑制MAO，iNOS活性，降低皮質(zhì)酮和NO水平，減輕其對(duì)海馬的損傷等多方面發(fā)揮抗抑郁作用。然而心腦欣膠囊對(duì)抑郁模型大鼠HPA軸其它方面的作用 （如下丘腦CRH濃度、CRH mRNA的表達(dá)）、腦內(nèi)單胺遞質(zhì)的含量以及心腦欣膠囊發(fā)揮抗抑郁作用的物質(zhì)基礎(chǔ)等還有待于進(jìn)一步研究。

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