醋狼毒（月腺大戟）HPLC指紋圖譜*

狄恒建，莊 果，李俊松**

1江蘇省食品藥品檢驗所，南京 210008；

2南京中醫藥大學江蘇省中藥炮制重點實驗室，南京 210029

狼毒，大戟科植物月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata.或狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.的干燥根，始載于《神農本草經》，有毒，具有逐水祛痰、散結殺蟲的功效[1]。狼毒生品藥性峻烈，毒副性作用大，經醋炙后毒性降低，方可供臨床上內服[2]。《中國藥典》2010年版“狼毒”項下載有飲片生狼毒和醋狼毒；“生品”項下僅有性狀、顯微和薄層鑒別、雜質、水分、總灰分、浸出物和酸不溶性灰分等質控項目；“醋品”項下則無質控項目[3]。文獻多采用測定月腺大戟中主要藥效成分狼毒乙素和巖大戟內酯B等含量的方法來評價其質量的優劣[4-5]。

中藥指紋圖譜是采用一定的分析手段，得到能夠標示其化學特征的色譜圖[6-7]，其作為質量控制模式可以綜合反映藥材中各主要成分及其相對含量，能提供更加豐富的質量評價信息。為了更全面控制醋狼毒（月腺大戟）飲片質量，本研究采用HPLC法建立了醋狼毒（月腺大戟）指紋圖譜。該方法可靠，重復性好，操作簡便。儀（Agilent公司），含DAD檢測器；AG285電子天平（瑞士Mettler公司）；KQ-3200E型超聲清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

狼毒乙素、狼毒丙素對照品為本實驗室自制，經波譜學方法鑒定結構，并由色譜法確定其純度分別為99.0%和98.7%。

狼毒藥材來源見表1，經南京中醫藥大學中藥鑒定教研室劉訓紅教授鑒定為大戟科大戟屬植物月腺大戟的干燥根；樣品1～7號的醋炙飲片為本實驗室按已考察過的炮制方法自制 （輔料醋用量為40%，悶潤1 h至醋被吸收干凈，160℃下炒制10 min）；樣品8～10號為南京海昌中藥飲片公司按本實驗室提供方法炮制的中試放大產品。

甲醇為分析純；乙腈為色譜純；水為娃哈哈純凈水；醋為江蘇鎮江恒順香醋 （總酸量≥4.5 g/100 mL）。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

Agilent1100四元泵全自動進樣高效液相色譜

表1 樣品來源

2 色譜條件

Welchorm-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相：乙腈（A%）-水（B%），梯度洗脫（0～10 min，10%～15%A；10～11 min，15%～33%A；11～20 min，33%～40%A；20～30 min，40%～66%A；30～40 min，66%～68%A；40～42 min，68%～70%A；42～45 min，70%～80%；45～50 min，80%～90%A；50～60 min，90%～90%A），平衡時間 5 min。 檢測波長：226 nm；靈敏度：1.0 AUFS；柱溫：25℃；流速：l mL·min-1；進樣量：20 μL。

在上述色譜條件下，理論塔板數按狼毒乙素峰計算不小于3000。

3 溶液的制備

3.1 供試品溶液

取醋狼毒（月腺大戟）粉末（過6號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理 （功率250 w，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減少的重量，搖勻，濾過，精取續濾液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液即得。

3.2 對照品溶液的制備

取狼毒乙素適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含30 μg溶液，即得。

4 方法與結果

4.1 指紋圖譜方法學考察

參考 《中藥注射劑指紋圖譜的技術研究 （暫行）》，考慮到各樣品中均有狼毒乙素峰且含量較高，其保留時間及峰形穩定，分離度良好，故以此峰作為參照峰，計算醋月腺大戟HPLC指紋圖譜中其他色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，考察方法學。

4.1.1 精密度試驗精密吸取同一供試品溶液20 μL，連續進樣6次，檢測指紋圖譜。

結果，各共有峰相對保留時間的RSD在0.02%～0.71%，相對峰面積RSD均小于3%，6次進樣共有圖譜的相似度均大于為0.96，精密度良好，符合指紋圖譜要求。

4.1.2 重復性試驗取同一批醋狼毒粉末5份，按“3.1”項下方法制備供試品溶液，分別檢測指紋圖譜。結果，以狼毒乙素峰的保留時間和峰面積為參照，各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD均小于4%，5次進樣共有圖譜的相似度均大于0.99，重復性良好，符合指紋圖譜要求。

4.1.3 穩定性試驗取同一供試品溶液適量，分別于 0、2、4、8、12、24 h 檢測指紋圖譜。結果，各共有峰相對峰面積及相對保留時間的RSD＜3%，共有圖譜的相似度＞0.9，供試液在24 h內穩定，符合指紋圖譜要求。

4.2 醋狼毒（月腺大戟）指紋圖譜共有模式的建立及相似度比較

4.2.1 醋狼毒（月腺大戟）指紋圖譜及特征峰的標定對10批不同醋狼毒（月腺大戟）樣品按“3.1”項下方法制備供試品溶液，分別進行測定，記錄60 min內的色譜圖。

采用 《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004年A版）》，對10批醋月腺大戟的指紋圖譜進行考察，以保留時間約為26.55 min的12號色譜峰（狼毒乙素）作為參照峰，確定了23個共有特征指紋峰（見圖1），10批供試品的疊加圖見圖2。

圖1 醋狼毒（月腺大戟）HPLC指紋圖譜

圖2 醋狼毒（月腺大戟）10批供試品的共有模式圖

4.2.2 醋狼毒相似度比較參考《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》，對10批醋狼毒指紋圖譜進行相關技術參數的計算，結果顯示其共有峰的相對保留時間的RSD均小于0.9%，相對峰面積的RSD均小于1.8%；通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》對醋狼毒（月腺大戟）10批飲片指紋圖譜進行相似度評價，發現大多數樣品相似度良好，平均相似度為0.962，結果見表2。

5 討 論

5.1 采用不同溶劑（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水）、不同提取方法（回流提取和超聲提?。┘疤崛r間（20 min、30 min、60 min）對醋狼毒（月腺大戟）供試液提取方法進行考察，并根據指紋圖譜對不同提取方法提取液進行分析，結果表明，用甲醇作為溶劑超聲提取30 min就能夠將醋月腺大戟中化學成分較完全提取出來，且此方法提取10批生品樣品的相似度較好。

表2 10批醋狼毒 （月腺大戟）相似度計算結果

5.2 醋狼毒（月腺大戟）HPLC指紋圖譜可靠，建立的方法學良好，反映了醋狼毒的整體特征，可用于醋狼毒（月腺大戟）質量控制和質量標準的建立。

[1]徐樹楠，朱占民.神農本草經[M].石家莊：河北科學技術出版社，1994：131；1982：110.

[2]顏秉強，張永清.月腺大戟研究進展[J].山東中醫藥大學學報，2008，32（5）：432-5.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 （一部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：269

[4]喬春峰，韓全斌，賀震旦，等.RP-HPLC法測定狼毒中巖大戟內酯A和 B的含量 [J].藥物分析雜志，2006，26（9）：1204-6.

[5]謝演暉，嚴小紅，王燦堅，等.RP-HPLC法測定月腺大戟中狼毒乙素的含量 [J].中藥材，2010，33 （4）：568-70；269.

[6]謝培山.中藥色譜指紋圖譜鑒別的概念、屬性、技術與應用[J].中國中藥雜志，2001，26（10）：653.

[7]國家藥品監督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）[J]. 中成藥，2000，22（10）：671.