響應面法優化玄參提取工藝研究*

黃萌萌 ，喬娟娟 ，邱亞玲 ，吳 剛 ，秦民堅 **

1中國藥科大學中藥資源學教研室，江蘇南京 211198；

2中國藥科大學教育部現代中藥研究重點實驗室，江蘇南京 210009

中藥玄參為玄參科植物玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的干燥根，始載于《神農本草經》，列為中品，具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結的功效，用于治療熱入營血、溫毒發斑、熱病傷陰等癥狀[1]?，F代藥理研究表明，玄參具有鎮痛、抗炎、抗菌、保肝、抗氧化、增強免疫等作用，其藥理活性的主要物質基礎是環烯醚萜苷和苯丙素類成分，如桃葉珊瑚苷、哈巴苷、哈巴俄苷、6-O-甲基梓醇、毛蕊花糖苷、安格洛苷C、肉桂酸等[2-6]。近年來以多指標成分表征中藥品質成為中藥質量控制的主要手段[7]，因此中藥提取工藝的優化也應當以多成分為導向。周宏偉[8]等采用星點設計-效應面法，以環烯醚萜苷中哈巴苷、哈巴俄苷總提取率為指標，考察了玄參的提取工藝，研究表明，18%～32%乙醇，液料比20∶1～26∶1，提取30～48 min時，玄參總提取率最高。目前，玄參提取工藝的優化主要以環烯醚萜為考察指標進行優化，而對以環烯醚萜苷和苯丙素同時作為考察指標的提取工藝研究較少見。本研究建立了同時測定桃葉珊瑚苷、哈巴苷、哈巴俄苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷C、肉桂酸等6個指標成分的HPLC方法，并以此6個指標成分總峰面積為響應值，采用Box-Behnken Design響應面分析法 （BBD-RSM）優化玄參的提取工藝，以期為玄參質量的全面控制提供理論依據。

1 材 料

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-M20A紫外檢測器，四元泵，DGU 20A 5R脫氣機，CTO－20AC柱溫箱，SIL－20A自動進樣器，Lab Solutions工作站 （島津公司）；Sartorius BS 210 S型電子天平 （Sartorius）；BT 125D 分析天平 （Sartorius）；KQ-500DV型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；優普超純水系統 （成都超純科技有限公司）；FW100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱 （上海博迅實業有限公司）；TDL大容量低速離心機（飛鴿）；Eppendorf Centrifuge 5417 R（德國 Eppendorf）等。

1.2 試劑與藥品

乙腈（HPLC，Tedia）；磷酸（分析純，南京化學試劑有限公司）；三蒸水（自制）；甲醇（分析純，江蘇漢邦科技有限公司）。桃葉珊瑚苷 （批號：MUST-12032606）、哈巴苷（批號：MUST-12121902）、哈巴俄苷（批號：MUST-12032606）、安格洛苷 C（批號：MUST-12051502），以上對照品均購于成都曼思特生物科技有限公司；毛蕊花糖苷（批號：120622，上海士鋒生物科技有限公司)；肉桂酸(批號：110786，中國食品藥品檢定研究院）。對照品純度采用HPLC面積歸一化法，均≥98%。

考察提取工藝所用玄參樣品來源于浙江磐安，為新鮮玄參塊根切片陰干所得。樣品經本研究組通訊作者秦民堅鑒定為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的根。樣品粉碎，過60目篩，備用。

2 方法與結果

2.1 HPLC色譜條件建立

2.1.1 色譜條件漢邦Merges C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；漢邦 C18預柱；流動相為乙腈（B）-0.03%磷酸水溶液（A），梯度洗脫程序如下：1%～2%B（0～5 min），2%～10%B （5～16 min），10%～14%B （16～21 min），14%～30%B（21～38 min），30%～56%B（38～48 min），56%～65%B（48～55 min），65%～90%B（55～60 min）。 流速 1.0 ml·min-1；柱溫 30℃；檢測波長：桃葉珊瑚苷、哈巴苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷C為210 nm，哈巴俄苷、肉桂酸為280 nm；進樣量10 μL。 對照品與樣品色譜圖見圖1A、圖1B。

圖1 對照品（A）與樣品（B）色譜圖

2.1.2 線性關系考察精密稱取對照品適量，加甲醇制成每毫升分別含桃葉珊瑚苷1.055 mg、哈巴苷0.395 mg、哈巴俄苷 0.41 mg、毛蕊花糖苷 0.35 mg、安格洛苷C 0.32 mg、肉桂酸0.175 mg的混合溶液，即得對照品混合儲備液，將此儲備液稀釋配制成不同濃度的對照品溶液，取10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積作縱坐標，進樣濃度（mg·mL-1）為橫坐標，用最小二乘法進行線性回歸，計算即得回歸方程及線性范圍，結果表明線性關系良好。

2.1.3 精密度考察取同一對照品混合溶液連續進樣5次，所得峰面積的RSD為日內精密度；同一樣品連續進樣3天，一天2次，所得峰面積的RSD為日間精密度。結果各成分色譜峰相對峰面積RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 供試品溶液制備取玄參粉末0.4 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，精密加入10 mL 90%甲醇，室溫超聲提取 30 min，3000 r·min-1離心 5 min，取上清液，殘渣再加入10 mL 90%甲醇，重復上述操作，合并上清液至25 mL容量瓶中，用90%甲醇定容至刻度，搖勻，取提取液 13000 r·min-1離心 10 min，取上清即得。

2.1.5 穩定性試驗取供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、8、12、24、48、72 h 進樣，測定峰面積，計算得桃葉珊瑚苷、哈巴苷、哈巴俄苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷C、肉桂酸含量的RSD分別為3.43%、1.17%、3.11%、3.92%、2.96%、0.62%， 表明供試品溶液在72 h內穩定性良好。

2.1.6 加樣回收率實驗取已知含量的玄參樣品0.2 g，共9份，精密稱定，按照高、中、低三個水平加入 150%、100%、50%量的標準品溶液，按“2.1.4”項下制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，計算其回收率。計算得桃葉珊瑚苷，哈巴苷、哈巴俄苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷C、肉桂酸的高、中、低三個水平的平均回收率為99.77%、103.35%、99.99% 、98.38% 、96.66% 、97.50% ，RSD 分 別 為4.63%、2.51%、1.98%、3.91%、1.66%、3.55%，表明方法準確可靠。

2.2 提取工藝考察

2.2.1 單因素考察結果見圖2。

提取溶劑考察：取玄參粉末0.4 g若干份，精密稱定，分別精密加入純水10 mL，30%、50%、70%、80%、90%、100%甲醇各 10 mL，50%、70%、100%乙醇各10 mL，均超聲30 min，提取兩次，合并上清液至25 mL容量瓶中，用90%甲醇定容至刻度。結果表明，90%甲醇提取總峰面積最大，不同濃度乙醇提取率均無80%、90%、100%甲醇提取率高。圖2A表明隨著甲醇濃度的增大，提取率顯著增加，90%甲醇提取率最高，因此選擇80%～100%甲醇作響應面優化。

提取方式考察：取玄參粉末0.4 g，精密稱定，精密加入90%甲醇10 mL，分別超聲30 min、熱回流2 h、冷浸12 h，相同方式重復提取一次，合并上清液至25 mL容量瓶中，用90%甲醇定容至刻度。圖2B表明，超聲與加熱回流提取總峰面積高于冷浸法，加熱回流提取率略高于超聲提取，但超聲提取可達到熱回流提取率的97.6%，由于超聲提取操作簡單方便，因此選擇超聲提取。

圖2 單因素考察結果

提取次數考察：取玄參粉末0.4 g，精密稱定，精密加入90%甲醇10 mL，超聲提取30 min，分別提取1、2、3次，合并上清液至50 mL容量瓶中，用90%甲醇定容至刻度。圖2C表明超聲提取2次效果優于1次，而與3次沒有顯著性差異（P＞0.05），因此提取2次與三次效果相當，綜合考慮，選擇超聲提取2次。

液料比考察：取玄參粉末0.4 g，精密稱定，分別加入 5 mL、10 mL、15 mL、20 mL 90%甲醇， 超聲提取，重復提取一次，合并上清液至50 mL容量瓶中，用90%甲醇定容至刻度。圖2D表明料液比從1∶12.5～1∶37.5 時，總峰面積（Total peak area）先增大，后逐漸減小；當液料比繼續增大時，指標峰總峰面積繼續降低。綜合考慮提取成本等因素，選定液料比在 1∶12.5～1∶37.5區間內作響應面優化。 即 0.4 g藥材分別加入5、10、15 mL溶劑。

提取時間考察：取0.4 g玄參粉末，精密稱定，加入 90%甲醇 10mL， 分別超聲提取 20、30、40、50 min，重復提取一次，合并上清液至25 mL容量瓶中，用90%甲醇定容至刻度。圖2E表明超聲提取30 min總峰面積最大，超聲提取時間再延長，則總峰面積減小。因此選定超聲時間在20～40 min區間作響應面優化。

2.2.2 響應面優化根據單因素實驗考察結果，由于提取次數為非連續變量，回歸處理比較困難，因此將提取次數定為兩次，以甲醇濃度、提取時間、料液比作為考察變量，分別用X1、X2、X3表示。根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，以6個指標成分總峰面積Y響應值，采用Design expert software軟件設計三因素三水平的響應面試驗，共17組實驗，包括5組中心點實驗，求取最優的提取工藝參數。具體試驗設計方案和結果見表1、表2。

表1 BBD因素水平表

表2 BBD-RSM實驗順序與響應值結果（n=3）

采用Design-Expert 8.0.0軟件對表2中的實驗結果進行分析，結果表明二次多項式回歸模型較優，對結果進行二項式擬合，主要成分提取的數學模擬如下：

式中Y為玄參主要活性成分提取率（以6個分析物的總峰面積值表示），X1為甲醇濃度 （%，v/v），X2為超聲時間（min），X3為液料比（mL/0.4 g）。

當P＜0.05時，影響因素對響應值的影響為顯著性差異，當P＜0.01時為極顯著差異。對以上回歸方程進行方差分析，結果見表3，可以看出模型的P值為0.0051，說明該模型得到的回歸方程是顯著的，失擬項值為0.3468，即方程模型失擬不顯著，實驗設計可靠，模型相關系數r2=0.9157，進一步說明模型具有較好的可信度。方差分析的結果表明方程的總模型、提取時間、液料比及甲醇濃度和液料比的二項式對玄參提取率的影響達顯著水平，而交互項對提取率的影響不顯著。在所選取的各因素水平范圍內，按照對結果的影響排序，液料比＞超聲時間＞甲醇濃度。

表3 BBD-RSM回歸方程的方差分析表

圖3是甲醇濃度、提取時間、液料比提取率的響應面曲面圖。隨著X1、X2、X3取值增大，響應值增大，當達到極值后，隨著各因素值增大，響應值減小。由圖3響應面曲面圖可知該模型有穩定點，且穩定點是其最大值。利用Design-Expert軟件中Point Prediction進行預測，可獲得一組響應值最大的優化條件：甲醇濃度88.15%，提取溶劑14.49 mL/0.4 g（即液料比 36.23），超聲 25.65 min，在此優化條件下，提取總峰面積預測值3.12×106，采用改良條件（甲醇濃度88%，液料比36，超聲提取26 min）進行驗證試驗，結果平均提取總峰面積為3.11×106（n=3），與理論提取值接近，偏差小于1%。

3 小結與討論

響應面法將回歸方程作為函數估算的工具，將多因子試驗中因素與試驗結果的關系用多項式擬合，將因子與實驗結果的關系函數化，克服了正交實驗只能給出最佳因素水平組合而無法找出整個區域上因素的最佳組合和響應值的最優值的缺陷。由于其設計方法簡單，實驗結果精度高，響應面優化法在中藥領域的應用越來越廣泛[9-11]。

圖3 響應面曲面圖

本實驗在參照文獻[12]的基礎上建立玄參中3種環烯醚萜苷（桃葉珊瑚苷、哈巴苷、哈巴俄苷）和3種苯丙素類（毛蕊花糖苷、安格洛苷C、肉桂酸）的同時測定方法，并以環烯醚萜苷和苯丙素類提取率為指標考察玄參的提取工藝。通過單因素實驗，以及三因素三水平Box-Behnken Design響應面法實驗，建立了提取率與各影響因素之間的數學模型。根據二次多項式回歸模型，確定玄參的最佳提取工藝參數：甲醇濃度88.15%，液料比36.23，超聲25.65 min，提取兩次。理論值與實測值R偏差小于1%。該優化工藝可以為玄參質量全面控制及工業化提取提供參考。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國國藥典：一部[S].中國醫藥科技出版社，2010：108-9.

[2]謝小艷，夏春森.中藥玄參的化學成分及藥理研究進展[J]. 亞太傳統醫藥，2010，6（5）：121-4.

[3]李醫明，曾華武.玄參中環烯醚萜苷和苯丙素苷對LTB4產生及血小板聚集的影響 [J].第二軍醫大學學報，1999，20（5）：301-3.

[4]黃才國，李醫明，賀 祥，等.玄參中苯丙素苷對大鼠肝損傷細胞凋亡的影響[J].中西醫結合肝病雜志，2004，14（3）：160-1.

[5]尚雁君，李醫明，蔣山好，等.玄參中苯丙素苷Acteoside對小鼠高尿酸血癥的影響[J].解放軍藥學學報，2006，22（1）：30-2.

[6]季金玉，張 云，叢曉東，等.玄參的化學成分及質量控制研究進展[J]. 中華中醫藥學刊，2010，28（12）：2507-10.

[7]劉榮霞，葉 敏，果德安，等.中藥質量控制研究的思路與方法[J]. 中國天然藥物，2006，4（5）：332-7.

[8]周洪偉，郝麗靜，楊 勇，等.星點設計－效應面法優化玄參提取工藝[J]. 世界中醫藥，2012，7（5）：455-7.

[9]趙衛星，孫治強，高玉紅，等.響應面法優化百部總生物堿提取工藝的研究[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2008，36（7）：185-90.

[10]黃元紅，衛天喜，張發生，等.星點設計－效應面法優選丹參提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（17）：28-31.

[11]徐定華，朱文學.響應面分析法優化懷地黃中梓醇提取的工藝參數[J]. 食品科學，2011，32（16）：62-6.

[12]Cao G,Cong XD,Cai H,et al.Simultaneous quantitation of eight active components in crude and processed Radix Scrophulariae extracts by high performance liquid chromatography with diode array detector[J].Chin J Nat Med,2012,10(3):213-7.