青風藤醇提物與青藤堿治療膠原誘導關節炎大鼠藥效的比較研究*

姚 瑤，葛衛紅

南京大學醫學院附屬鼓樓醫院藥學部，南京 210008

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種臨床常見的以侵犯滑膜關節為主的炎性自身免疫病，其發病機制復雜，病變過程涉及多種細胞。青風藤，拉丁名Sinomenium acutum，是防己科植物青藤及毛青藤的干燥藤莖[1]，具有祛風濕、通經絡等作用，臨床主要用于治療類風濕性關節炎、紅斑狼瘡等免疫系統疾病。青風藤中包括如青藤堿（sinomenine，SIN）、 小 檗 堿 （berberine）、 青 風 藤 定 堿（sinomendine）等。青藤堿在青風藤中含量最多，高達2%[2]，具有抗炎、鎮痛、免疫調節等作用，目前有青藤堿片和緩釋片兩種劑型在臨床使用，治療RA有效，可以一定程度地緩解關節炎癥和抑制骨破壞。與此同時，其他一些成分也有鎮痛、抗炎抗風濕成分以及免疫抑制的作用，都有可能對RA起到相關治療作用[3]，如小檗堿是一種異喹啉類生物堿，具有廣泛的藥理作用，包括抗發炎。李宇馨等[4]研究表明，小檗堿通過抑制小鼠PGE2的產生，發揮抗炎和鎮痛作用。Jeong等[5]研究發現小檗堿在巨噬細胞通過激活磷酸腺苷酶 （amp-activated protein kinase，AMPK）來抑制炎癥反應。青風藤與青藤堿單體對RA治療作用的比較鮮見報道。本研究考察和比較青風藤醇提物與青藤堿單體對膠原誘導關節炎大鼠治療作用的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡SPF級健康Sprague-Dawley（SD）大鼠50只，雌性，體質量150～170 g，由浙江省實驗動物中心提供，生產批號：scxk （浙）2008-0033，南京市鼓樓醫院動物實驗中心飼養，適應性喂養3天后開始用于實驗。

1.2 試材與試劑

青風藤干燥藤莖（產于浙江，購于南京藥業股份有限公司，批號：101028，經南京中醫藥大學吳啟南教授鑒定為防己科植物青藤藤莖）；正清風痛寧片（湖南正清藥業有限公司，批號：0907101）；天然牛Ⅱ型膠原蛋白（批號：C-7806）；完全弗氏佐劑（批號：C-9007）；IL-17酶聯免疫吸附測定試劑盒 （批號：10090913）、RANKL酶聯免疫吸附測定 （批號：10090909）、OPG酶聯免疫吸附測定試劑盒 （批號：10090913），均購于美國Sigma公司。所用化學試劑均為色譜純；實驗用水為超純水。

1.3 儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀及附件；ELx800吸收光酶標儀，美國BioTek公司產品。

1.4 色譜條件

色譜柱為 ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水（用磷酸及三乙胺調整pH至7.8）-乙腈（40∶60）；柱溫為 30；流速為 1.0 mL·min-1；檢測波長為 262 nm；進樣量 20 μL。

1.5 試藥的制備

青風藤干燥藤莖粉碎，12倍藥量95%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并濃縮液，回收膏狀溶劑，每毫升相當于生藥50 g，加水稀釋，使青風藤醇提物混懸液含2 mg·mL-1生藥。正清風痛寧片研磨，加入適量乙醇，溶解，再加水制成2 mg·mL-1青藤堿的混懸液。

1.6 大鼠關節炎模型的制備

50只大鼠稱體重后，隨機分為對照組10只以及造模組40只。將溶于醋酸的Ⅱ型膠原蛋白先于4℃低溫保存過夜，第二天與完全弗氏佐劑以等體積乳化。乳化成功后，對模型組大鼠背部及尾部多點行皮下注射，誘導類風濕關節炎模型，每只大鼠0.15 mL，7 d后進行第二次注射，方法與首次注射相同。對照組大鼠注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.7 關節評分

關節腫脹評分標準：關節處無腫脹，0分；趾關節微腫，1分；趾關節及足趾處發生腫脹現象，2分；踝關節以下的足爪發生腫脹現象，3分；全部足爪腫脹（包括踝關節），4分。大鼠最終分數為四肢關節腫脹分數總和，最高分為16分。首次免疫注射后每3天稱重1次，每次固定兩名實驗員記錄關節腫脹評分（arthritis index，AI）[6]。

1.8 分組與給藥

造模第21天關節評分，AI＞4的認定為造模成功。其中8只未成模棄用，32只成模大鼠又隨機分為模型組（n=12）和青風藤組、青藤堿組（n=10）。 開始給藥：青風藤組灌胃給予青風藤醇提液，使青藤堿為 10 mg·kg－1·d－1；青藤堿組灌胃給予青藤堿的混懸液，使青藤堿為 10 mg·kg－1·d－1；模型組與對照組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液；持續36 d。

1.9 炎癥因子測定

實驗結束后，禁食一夜，次日于大鼠眼眶取血，ELISA法測定血清中白介素-17（interleukin-17，IL-17）、NF-κB 配位體受體活化劑（receptor or activator of NF-KB ligand，RANKL）以及可溶性蛋白骨保護素（osteoprotegerin，OPG）水平，按試劑盒說明書操作。

1.10 統計學方法

2 結 果

2.1 青風藤中青藤堿含量測定

在“1.4”色譜條件下，青藤堿得到較好的分離，無明顯干擾峰出現，保留時間約為6.9 min，色譜圖見圖 1-A。 回歸方程為：Y=19.836X+684.45，r2=0.9989，最低檢測濃度0.12 mg·L-1。青藤堿的青風藤乙醇回流冷凝提取，醇提液超速離心15 min，上清液按照“1.4”色譜條件進樣，色譜圖見圖1-B。根據醇提液中的青藤堿含量計算每百克生藥中青藤堿的含量，青風藤中的青藤堿含量約為2%，與文獻報道一致。繼而用適量青風藤制成醇提液，濃縮成膏狀，加入純化水稀釋，制成青藤堿含量為2 g·mL-1的混懸液。

圖1 青藤堿色譜圖（A）與青風藤色譜圖（B）

2.2 大鼠關節評分

成模大鼠關節急性期表現為紅、腫，以對稱性后肢關節為著，累及踝關節、膝關節、趾間關節等，關節癥狀一般自后足首發，癥狀呈進行性加重，后肢在初次免疫后20 d左右出現第一個炎癥高峰，即刻開始給藥，每3天記錄關節評分，見圖2。藥物治療后，大鼠關節腫脹明顯減輕，在整個治療過程中呈顯著下降趨勢，而模型組大鼠關節炎評分一直居高不下，在第35天再次達峰，提示關節炎進入慢性狀態。治療結束第58天，模型組（model）大鼠關節評分高至7.5分，大鼠消瘦且皆蜷縮于角落，畏寒、足腫脹嚴重，而青風藤醇提物組 （QFT）和青藤堿組（SIN）大鼠均得到不同程度的緩解，見圖3。且青風藤醇提物組關節炎評分低于青藤堿組（P＜0.05）。

圖2 實驗中各組大鼠AI變化趨勢

圖3 第58天模型組與治療組的AI比較

2.3 各組大鼠血清IL-17、RANKL、OPG測定

青風藤醇提物組IL-17、RANKL水平顯著低于模型組（P＜0.05），但未能降低到對照組水平；青藤堿組IL-17、RANKL未能得到很好的控制，與模型組無顯著差異（P＞0.05）；青風藤醇提物組RANKL水平顯著低于青藤堿組（P＜0.05）。青藤堿組和青風藤醇提物組OPG水平顯著高于模型組（P＜0.05），其中青藤堿組OPG水平與正常組相比無顯著性差異（P＞0.05）。 見表 1。

表1 各組大鼠血清IL-17、RANKL、OPG水平（pg·mL-1，±s）

表1 各組大鼠血清IL-17、RANKL、OPG水平（pg·mL-1，±s）

注：*表示與模型組比較P＜0.05， ＆ 表示與青藤堿組比較P＜0.05

組別 n IL-17 RANKL OPG對照模型青風藤醇提物青藤堿10 12 10 10 221.05±82.76*574.53±72.37 412.28±95.21* ＆ 544.79±81.23 126.76±37.85*202.16±20.16 167.44±14.68* ＆ 238.53±47.82 67.20±5.58*38.14±8.03 51.55±7.22*67.52±6.65*

3 討 論

膠原誘導的關節炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型由Trentham[7]于1977年首次報道，該模型經常用于研究治療類風濕性關節炎的藥物，本研究應用該模型探討傳統中藥的醇提物與其有效單體在大鼠體內藥效的差異。實驗結果提示，青風藤醇提物與青藤堿均能有效緩解膠原誘導的關節炎腫脹，并且能夠恢復關節功能；而青風藤醇提物能夠有效降低IL-17、RANKL的分泌，提高OPG的水平；青藤堿對IL-17、RANKL的作用不顯著，卻能顯著提高OPG水平。

IL-17是一種強大的前炎癥細胞因子，也是炎癥反應的微調因子，由Th17細胞分泌產生，可以刺激成纖維細胞、角質細胞、上皮及內皮細胞釋放IL-6、IL-8、前列腺素E2（PGE2）、基質金屬蛋白酶MMP等，還可誘導人成纖維細胞表達細胞間粘附分子（ICAM-1）, 促進T細胞增殖[8]。然而，目前并未有研究指出青藤堿能夠直接抑制Th17的分泌，Yan LC等的研究表明，青藤堿低劑量時不能發揮其抗炎作用，反而青藤堿的一類衍生物能夠顯著抑制Th17的表達，從而減少IL-6、TNF-α的分泌，調節免疫。這與本研究結果類似，同時推測青風藤醇提物中是否存在與青藤堿結構類似的衍生物，能夠發揮調節免疫的作用，有待進一步研究[9]。

類風濕慢性炎癥的結果是骨破壞，最終致殘，青藤堿與青風藤醇提物均能有效提高OPG水平，青風藤醇提物能夠顯著抑制RANKL的分泌。OPG與RANKL競爭性地結合到破骨細胞前體細胞的RANK上，抑制破骨細胞的活化。破骨細胞是RA骨破壞進程中發揮關鍵作用的細胞。RANKL來源于位于滑膜內膜層的成纖維樣滑膜細胞 （fibroblastlike synoviocytes，FLS），它在RA病變中異常活化，是介導滑膜局部炎癥的關鍵細胞之一，近年來研究發現它也是參與關節破壞的主要效應細胞[10]。本研究提示，青風藤醇提物和青藤堿均能通過改善RANKL/OPG的比值有效抑制骨破壞，青風藤醇提物的作用可能更為顯著。Chen DP的研究表明，青藤堿能夠抑制TNF-α誘導的VCAM-1在正常FLS與RA-FLS的表達，抑制IL-6分泌[11]。Ou Y的研究提示，青藤堿能夠抑制RA-FLS的侵襲，并且降低MMPs的分泌，保護軟骨和骨[12。

總之，青藤堿能夠提高OPG水平，而青風藤醇提物對RANKL、IL-17分泌的抑制作用優于青藤堿，且青風藤醇提物中的系列生物堿成分的結構相似，都具有菲核結構，提示青風藤醇提物中可能存在其他青藤堿類似物，也能發揮抗炎抗骨破壞的作用，青風藤醇提物成分分析和具體機制仍有待進一步研究。

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