乳腺癌中17號染色體倍體性分析

陳順平 余英豪 吳文喬 周宗楷 謝飛來 沈洪武 王 烈

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，隨著分子生物學技術普遍應用，近年來對乳腺癌深入的研究提示了人類表皮生長因子受體2(Her-2)與乳腺癌的關系尤其密切［1］，與腫瘤發生發展與預后相關，有25%～30%的浸潤性乳腺癌和80%的乳腺導管內癌患者有Her-2基因擴增或蛋白過表達［2］，但對乳腺癌相關染色體倍體性與腫瘤惡性程度相關的研究較少，結論也不一致。有學者認為乳腺癌二體性腫瘤比多體性腫瘤預后為好［3］，但也有研究者得出完全相反的結論［4］。熒光原位雜交(FISH)技術是現今常用的分子技術，可檢測基因的擴增及染色體倍體性。因此，本研究應用了FISH及免疫組化(IHC)技術，檢測浸潤性乳腺癌中Her-2表達情況和17號染色體倍體性情況及其與臨床病理參數的關系，并分析其臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2010年5月－2012年12月我院收治的臨床資料完整的300例浸潤性乳腺癌，年齡25～89歲，中位44.5歲;其中年齡 ＜50歲158例，≥50歲142例。所有標本經10%中性緩沖福爾馬林液固定，常規石蠟包埋。同時進行IHC及FISH檢測。

1.2 主要試劑與儀器

酸性亞硫酸鈉(美國Simga產品)，蛋白酶K(美國羅氏產品)，探針:［GLP Her-2/CSP17探針］(購于北京金菩嘉公司)，Olympus BX51型熒光顯微鏡，Dake原位雜交儀，電熱恒溫水槽，隔水式恒溫培養箱。免疫組化試劑購于福州邁新生物公司，標記均設陽性對照，并用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3 方法

1.3.1 FISH檢測及其結果判斷 方法:①將3 μm組織涂膠切片浸于二甲苯中脫蠟至水。②50℃30%酸性亞硫酸鈉處理組織切片30～40 min。③室溫下2×SSC×3 min×2次漂洗。④在組織中滴加自配即用型蛋白酶K，37℃預熱孵育盒中消化20～25 min。⑤室溫下2×SSC×3 min×2次漂洗，乙醇梯度脫水固定，自然干燥。⑥避光環境中，配制探針混合液(7 μl雜交緩沖液、1 μl去離子水和2 μl探針)并滴于雜交區域，83℃自動雜交儀中變性6 min后置37℃過夜雜交。⑦洗滌:次日移去蓋玻片，46℃下，玻片置于2×SSC×10 min×2次，2×SSC/0.1%NP-40溶液中 5 min。玻片干燥后加DAPI復染液，置于暗盒中復染數分鐘后，在OLYMPUS BX51熒光顯微鏡DAPI/FIFC/RHOD三色濾光鏡激發下觀察間期細胞熒光雜交信號。結果判定:①Her-2基因:計數細胞核內紅色的Her-2基因熒光信號和17號染色體的綠色熒光信號的數目比值，即Ratio值(Ratio=30個細胞核中紅色信號總數/綠色信號總數)。Ratio值＜1.8為陰性，提示無基因擴增;Ratio＞2.2為陽性，提示基因擴增;Ratio在1.8～2.2時，增加計數細胞，重新對比。②17號染色體多體性標準:每個細胞中17號染色體數目在1.76～2.25 為二體性，≥2.26 為多體性［5］。

1.3.2 IHC檢測 方法及主要步驟:采用EnVision兩步法，嚴格按照說明書進行操作。結果判定:①Her-2蛋白判斷標準(2009年最新修訂意見):癌細胞胞膜著色為陽性染色，≥30%的腫瘤細胞呈現強及完整的細胞膜著色為陽性(+++)，輕及中度完整的細胞膜著色為可疑(++)，不完整染色或無染色為陰性(+或－)。②ER和PR蛋白判定標準:顯微鏡下計數100個腫瘤細胞中陽性細胞數，以任意5個高倍鏡視野中陽性細胞占細胞總數的百分數以及核染色程度作為評定依據，陽性細胞數≤5%為0分;6% ～25%為1分;26% ～50%為2分;＞50%為3分。染色強度:無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。上述兩項得分的乘積，為其最后得分。同一視野如有染色強度不一，取其平均值作為最后得分。0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性(++)，6分以上為強陽性(+++)。

1.4 統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件，結果比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 17號染色體多體與Her-2基因擴增及蛋白表達的關系

300例浸潤性乳腺癌標本中，17號染色體多體106例，占 35.33%;Her-2基因擴增 101例，占33.67%。Her-2基因擴增病例中17號染色體多體占55.44%(56/101)，無擴增病例中其占 25.13%(50/199);本組 Her-2蛋白(－ /+)163例(54.33%)，Her-2蛋白(++/+++)137例(45.67%)，Her-2蛋白(－/+)中17號染色體多體占15.34%(25/163)，Her-2蛋白(++/+++)中其占59.12%(81/137)，差異均有顯著統計學意義(P均＜0.01)(表1)。

2.2 17號染色體多體與浸潤性乳腺癌臨床病理參數的關系

17號染色體多體與患者年齡、淋巴結轉移及TNM分期均無相關性(P均＞0.05，表1)。

表1 17號染色體倍體性與浸潤性乳腺癌臨床病理參數的關系/例

3 討論

Her-2是1種原癌基因，定位于17號染色體，主要參與腫瘤細胞生長、增殖及分化，其過度表達常提示腫瘤惡性程度高、預后差，但該基因擴增的患者使用赫賽汀效果好，這已在諸多有關乳腺癌報道中得到證實。而有關17號染色體的研究較少，且結果也不盡相同，有13%～46%的浸潤性乳腺癌患者癌細胞為17號染色體多體，多體可能與乳腺癌的預后有關［5-6］，但也有一些學者提出相反的結論［7］。FISH和IHC技術是現今較常用基因擴增與蛋白表達檢測的方法，不僅準確率高，操作也簡便，已在臨床普及應用，而且FISH能定量出l7號染色體的倍體性，這2種方法相互補充可為有效判斷乳腺癌預后提供更多的理論依據。

本文應用FISH和IHC技術，對300例乳腺癌患者的Her-2及17號染色體進行檢測，結果顯示300例浸潤性乳腺癌標本中，17號染色體多體占35.33%，與國內外文獻報道相一致。17號染色體多體在Her-2基因擴增中占55.44%;無擴增中占25.13%，而在Her-2蛋白(－ /+)占15.34%;(++/+++)占 59.12%，差異均有統計學意義，提示浸潤性乳腺癌中17號染色體多體性更多的表現在Her-2方面，隨著Her-2基因擴增或者蛋白表達加強，多體情況不斷增加，同時結果也表明了17號染色體多體與Her-2的表達密切相關，可能是在Her-2表達異常時，癌組織細胞染色體更加不穩定造成的。且這種現象可能影響了Her-2基因或蛋白結果判斷的不確定性，由于染色體增加引起了Her-2基因位點的增加，可能造成了Her-2蛋白表達相應增強，而根據判斷標準Her-2基因并未擴增，這種現象可能是2種方法在檢測Her-2蛋白(++/+)結果不一樣的主要原因。所以FISH檢測Her-2基因擴增判斷標準中以17號染色體為內參照，一方面可以代表實驗的內質控情況，判斷實驗是否成功。如果組織細胞酶消化不合適情況下，無17號染色體綠色信號，單靠HER-2紅色信號判斷，很容易造成假陰性或假陽性。另一方面可以排除17號染色體多體引起了假擴增。但是IHC方面沒有內參照，而根據表1染色體多體可能是IHC假陽性原因，說明FISH在檢測基因擴增的同時還應檢測17號染色體倍體性，其結果比IHC更穩定，更準確。近來Varga等［8］認為乳腺癌中Her-2基因和17號染色體著絲粒可能存在共同擴增。國內學者楊飛等［9］也對此進行相關討論。也有學者把著絲粒附近的基因如p53、SMS或RARA作為代替17號染色體著絲粒作為內參照，發現部分乳腺癌患者Her-2狀態由無擴增變為擴增的現象［10-11］，所以他們認為Her-2基因擴增判斷標準中以17號染色體著絲粒為內參照不準確，我們認為上述學者的結論應得進一步探討，如果存在共擴增的話，有Her-2基因擴增的組織細胞內簇狀紅色信號應該也存在同樣成簇狀的17號染色體著絲粒綠信號，然而，我們在實際FISH檢測中并未發現。且Her-2擴增或無擴增情況下綠色信號數大部分都在6個信號點以下，所以我們認為應該不存在會造成Her-2擴增引起17號染色體著絲粒共擴增的現象。且著絲粒DNA序列比p53、SMS或RARA等基因更加穩定，而著絲粒DNA序列中發生基因擴增，片段插入、缺失等突變較少，是相對保守的DNA序列，而一般探針的設計也是選擇著絲粒最為保守的一段堿基對作為染色體探針代表。但是p53、SMS或RARA等基因發生基因突變幾率較大，特別是p53發生缺失是腫瘤發生發展的常見的表現形式，一旦發生基因突變，根據判斷標準說明Her2基因有無擴增并不準確。所以我們認為以17號染色體著絲粒為內參照較為準確。

在本組病例所得結果中，17號染色體多體顯示了與Her-2不同的遺傳學特征，在發病年齡，TNM分期以及淋巴結轉移等與多倍體組無明顯差異，說明其不是影響腫瘤發展相關因素，與腫瘤發展無明顯聯系，可能只是乳腺癌引起了1種染色體不穩定的表現。同時，表1結果中17號染色體在ER、PR(－/+)與(++/+++)有差異，而ER、PR表達與內分泌治療之間密切相關，17號染色體多體的乳腺癌患者是否說明內分泌治療效果差，至今尚未清楚，將有待于進一步研究。

綜上所述，我們認為17號染色體多體并未在浸潤性乳腺癌中顯示出不良的病理臨床意義，可能是FISH和IHC方法檢測結果不同的因素，17號染色體多體是乳腺癌常見遺傳學改變，是乳腺癌引起的1種染色體不穩定表現形式。其多體性與乳腺癌病情發展無關。

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