毛細管電泳法分離6種手性化合物

呂迎春，樊竹青，侯云洪

(普洱學院 生命科學系，云南普洱665000)

毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)是20世紀80年代崛起的一種分離分析技術。從1985年Gassmann E.［1］首次應用于手性分離以來，由于該技術具有分離效率高、分析時間短、樣品耗費少等優點，已被迅速應用于手性分離［2－7］。環糊精分子呈籠狀結構并含有多個手性中心，它能與客體分子形成超分子化合物，從而對客體分子產生多重的分子識別能力［8］。因此，環糊精類手性選擇劑是目前毛細管電泳手性分離應用得最廣的手性選擇劑。

氧氟沙星屬于第三代氟喹諾酮類廣譜抗菌藥，其分子結構中具有一個手性碳原子，從而產生S－(－)和R－(+)兩種光學異構體。近年來研究證明，左旋氧氟沙星抗革蘭氏陽性菌及陰性菌的活性是右旋的8～128倍，是氧氟沙星外消旋體的2倍［9］，其不良反應比氧氟沙星外消旋體低。因此，獲取抗菌能力強且毒副作用小的左氧氟沙星有著重要意義。布洛芬屬于非甾體抗炎鎮痛藥，具有鎮痛、退熱等作用，它主要通過可逆性的抑制環氧化酶來抑制作為炎癥介質的各種前列腺素的生成，起到解熱鎮痛抗炎的藥理作用。其分子結構中在β位有一個手性碳原子，存在一對光學異構體S－構型和R－構型，其中只有S－布洛芬具有主要的生理活性作用，而R－構型不僅活性低且有副作用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CL1020高效毛細管電泳儀(UV紫外檢測器波長范圍190～700 nm)和HW-2000色譜數據工作站，北京彩陸科學儀器有限公司;未涂層熔融石英毛細管(50 cm×50 um，有效長度41 cm)，河北永年光導纖維廠;羥丙基－β－環糊精(HP－β－CD)購于Sigma公司;氫氧化鈉、磷酸均為國產分析純試劑。實驗所用6種對映體標準品均購于中國藥品生物制品檢定所。分子結構見圖1。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

將手性化合物分別溶于10 mmol/L NaOH溶液中，配制成濃度為4 mmol/L的溶液后進行超聲溶解并保存于4℃環境中，在分析前再用背景電解質溶液進行適當稀釋。

于70 mmol/L H3PO4溶液中加入pH分別為1.0、2.1、2.5、3.0、3.8、4.3、5.0、6.0 和 7.0 的緩沖溶液，將一定量的HP－β－CD溶于其中。樣品和緩沖溶液用0.45 μm濾膜(水系)過濾，使用前在超聲波上脫氣5～10 min。

1.2.2 電泳條件

毛細管使用前分別用0.5 mol/L NaOH溶液、水及緩沖溶液各沖洗3 min。采用壓力進樣，進樣壓力 3.06 kPa，進樣時間 3 s，分離溫度25℃。

圖1 6種手性化合物的結構Figure 1 Structures of 6 chiral compounds

2 結果與討論

2.1 氧氟沙星對映體的分離

在分離氧氟沙星對映體時，如果背景電解質溶液的pH值大于4.3，則峰形變差。選擇pH為2.1，羥丙基－β－環糊精的濃度為40 mmol/L，分離電壓為10 kV，檢測波長為254 nm時，可在短時間內對氧氟沙星實現手性分離且重現性好。

在利用毛細管電泳分離氧氟沙星對映體的基礎上，將左旋的氧氟沙星標準品加入到其對映體混合物中，對其譜圖進行研究分析表明:對映體出峰的順序為S－(－)－氧氟沙星先出峰，R－(+)－氧氟沙星后出峰，如圖2－A所示。

2.2 特布他林對映體的分離

羥丙基－β－環糊精的濃度為40 mmol/L，分離電壓為10 kV，檢測波長為210 nm，調節磷酸鹽緩沖溶液的pH對出峰時間有明顯影響。pH值為6.0的出峰時間明顯比pH為2.5時的出峰時間短，其對應譜圖分別為圖2－B(1)、圖2－B(2)所示。

2.3 克倫特羅對映體的分離

磷酸鹽緩沖溶液pH值為2.5，羥丙基－β－環糊精溶液濃度為40 mmol/L，檢測波長254 nm。調節電壓分別為10、12、15 kV時，其CE譜圖分別為2－C(1)、圖2－C(2)和圖2－C(3)所示。分析譜圖顯示隨著電壓的增大，出峰時間明顯縮短，但峰高也變矮，因此選擇電壓12 kV時分離效果比較理想。

2.4 美托洛爾的分離

選取濃度為40 mmol/L的羥丙基－β－環糊精溶液，電壓為10 kV，檢測波長為204 nm時，研究了改變磷酸鹽緩沖溶液(70 mmol/L)pH對美托洛爾對映體分離效果的影響。實驗結果表明在pH值為6.0緩沖溶液環境下能實現美托洛爾的基線分離(圖2－D)。

2.5 扁桃酸的分離

選擇濃度為40 mmol/L的羥丙基－β－環糊精溶液，電壓為15 kV，檢測波長為206 nm時，改變磷酸鹽緩沖溶液(70 mmol/L)pH分別為2.5、5.0、6.0、7.0時，對扁桃酸對映體分離的研究。結果顯示磷酸鹽緩沖溶液pH=6.0時，能實現對扁桃酸的分離(見圖2－E)。

2.6 苯基丁二酸

選取濃度為40 mmol/L的羥丙基－β－環糊精溶液，電壓為10 kV，檢測波長為254 nm時，改變磷酸鹽緩沖溶液(70 mmol/L)pH分別為2.5、5.0、6.0、7.0時，對扁桃酸對映體分離的研究。結果顯示磷酸鹽緩沖溶液pH=6.0時，能實現苯基丁二酸的手性分離(見圖2－F)。

圖2 各手性化合物拆分的電泳圖Figure 2 Electropherograms of chiral compounds

3 結論

從上述結果得出，羥丙基－β－環糊精是一種理想的CE手性添加劑。以40 mmol/L的羥丙基－β－環糊精溶液、磷酸鹽緩沖溶液(70 mmol/L)pH為6.0、電壓10 kV，分離溫度為25℃時，僅改變檢測波長分別為254、210、204時，可同時實現苯基丁二酸、特布他林、美托洛爾等3種對映體的手性分離;以40 mmol/L的羥丙基－β－環糊精溶液，電壓10 kV，分離溫度為25℃，檢測波長為254 nm時，僅改變磷酸鹽緩沖溶液(70 mmol/L)pH值分別為2.1、2.5時就能實現氧氟沙星、克倫特羅的手性分離。因此，僅對少數影響分離條件的調整，即可實現幾種對映體的分離，從而提高了工作效率。同時，氧氟沙星對映體出峰順序的確定可為與氧氟沙星結構相似的對映體毛細管電泳分離提供定性分析的依據。

［1］Gassmann E，Kuo J E，Zare R N.Electrokinetic separation of chiral compounds［J］.Science，1985，230:813-814.

［2］Arai T，Nimura N，Kinoshita T.Investigation of enantioselective ofloxacin-albumin binding and displacement interactions using capillary affinity zone electrophoresis［J］.Biomedical chromatograpiiy，1995，9:68-74.

［3］Zhou S，Ouyang J，Baeyens W R，et al.Chiral separation of four fluoroquinolone compounds using capillary electrophoresis with hydroxypropyl-β-cyclodextrin as chiral selector［J］.Chromatogr.A，2006，1130:296-301.

［4］王偉，張永利，董英茹，等.毛細管電泳法手性分離5種堿性藥物［J］.藥物分析雜志，2007，27:1984-1987.

［5］俞犄，王義明，羅國安.俞氧氟沙星對映體的毛細管電泳手性分離［J］.藥學學報，1997，32:203-206.

［6］韋壽蓮，鄧光輝.手性藥物的毛細管電泳拆分［J］.分析測試學報，2007，26:907-910.

［7］Abushoffa A M，Fillet M，Hubert P，et al.Chiral separation of basic drugs capillary electrophoresis with carboxymethylcyclodextrins［J］. Chromatogr. A，2002，948:321-329.

［8］袁黎明.手性識別材料［M］.北京:科學出版社，2010.

［9］Hayakawa I，Atarashi S，Yokohama S，et al.Synthesis and antibacterial activities of optically active ofloxacin［J］.Antimicrob.Agents Chemother.，1986，29:163-164.