野生中草藥的抗氧化活性研究

楊新周，郝志云，董 毅，朱以常

(德宏師范高等專科學校理工系，云南德宏678400)

自由基誘發氧化損傷對身體健康影響極大，它與很多疾病息息相關，是引起衰老的主要原因［1－3］。自由基能引發白內障、冠心病、癌癥等疾病［4］。近年來，對自由基清除作用及機理的研究成為熱點，從植物中尋找具有抗氧化作用的天然活性成分越來越受到人們的關注。田基黃及馬蹄菜是兩種常見的中草藥，生于山間、田野較濕潤的地方，田基黃為藤黃科植物，原名地耳草(Hypericum Japonicum Thumb)，別名雀舌草，主要用于治療瀉痢、傳染性肝炎、小兒驚風、清熱解毒、疳積，蛇蛟傷，腸癰等。馬蹄菜又叫“積雪草”(Centella asiatica(L.)Urb)，傣族稱其為“帕朗”，傣族喜歡涼拌食用，具有消腫解毒、清熱利濕的功效［6］。目前，對這兩種中草藥研究較多的是化學成分的分離及鑒定、揮發油的測定等［5，7］，對這 2 種中草藥清除DPPH自由基及羥自由基的研究鮮見報道。筆者通過對這兩種中草藥乙醇提取物清除自由基能力的測定，希望能為該中草藥的綜合利用提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

V-1100型可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)，數字顯示恒溫水浴鍋(HH-S24S，上海君竺儀器制造有限公司)，超聲波(SK2200H)，電子天平(AR224CN)，電熱真空干燥箱(ZK 82J型)，旋轉蒸發儀(EYELA N一1100)。

DPPH(1，1－二苯基－2－三硝基苯肼)，質量分數＞99.0%(國藥集團化學試劑有限公司);田基黃、馬蹄菜(采于云南德宏州，烘干，粉碎，過篩);槲皮素、山奈酚、咖啡酸、蘆丁、沒食子酸、對香豆酸(購自國藥集團浙江華東醫藥有限公司，質量分數＞98%);番紅花紅、EDTA-Fe2+(現配現用)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、雙氧水(現配現用)、乙醇等試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗過程

1.2.1 DPPH儲備液的制備

準確稱取10 mg DPPH，用無水乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中，得質量濃度為0.1 mg/mL的儲備溶液。然后稀釋成0.024 mg/mL的標準溶液。

1.2.2 提取物的制備

準確稱取2.0000 g樣品于100 mL的錐形瓶中，加入20 mL的乙醇溶液，封口，超聲提取3次，每次45 min，合并3次濾液于旋轉蒸發儀中濃縮，轉移到25 mL的容量瓶中，乙醇定容，備用。

1.2.3 清除DPPH自由基能力的測定

準確移取4.5 mL DPPH標準溶液液，依次加入一定體積的提取物稀釋液于10 mL比色管中，定容至5 mL，置于暗處30 min，在波長517 nm下測定空白DPPH的吸光度值A空白和加入提取物后DPPH的吸光度值 A樣品，按下式計算自由基清除率［8］。

1.2.4 清除羥自由基(·OH)能力的測定

①調零管:準確移取1.00 mL PBS于10 mL比色管中，加入3.5 mL的水，37℃水浴中恒溫30 min，室溫下冷卻，調零。

②對照組:依次加入1.00 mL PBS、1.50 mL 40 μg/mL 番紅花紅、1.00 mL EDTA－Fe(Ⅱ)、1.00 mL蒸餾水于10 mL比色管中，37℃水浴中恒溫30 min，室溫下冷卻，測定吸光度A(λ=520 nm)，V總=4.50 mL。

③空白組:依次加入1.00 mL PBS、1.50 mL 40 μg/mL 番紅花紅、1.00 mL EDTA－Fe(Ⅱ)、1.00 mL 3%H2O2于10 mL比色管中，37℃水浴中恒溫30 min，室溫下冷卻，測定吸光度A0(λ =520 nm)，V總=4.50 mL。

④樣品組:依次加入1.00 mL PBS、1.50 mL 40 μg/mL 番紅花紅、1.00 mL EDTA－Fe(Ⅱ)、10.0 μL不同濃度的樣品溶液、1.00 mL 3%H2O2于10 mL比色管中，37℃水浴中恒溫30 min，室溫下冷卻，測定吸光度As(λ =520 nm)，V總=4.50 mL［9］。羥自由基清除率按下式計算。

2 結果與討論

2.1 對DPPH自由基清除能力

按照1.2.3的方法測定田基黃和馬蹄菜提取物清除DPPH自由基活性的能力，以清除率對總固形物濃度作圖，實驗結果見圖1和圖2。從圖1和圖2中看出，當田基黃和馬蹄菜總固形物濃度較低時，DPPH清除率與濃度呈線性關系，田基黃提取物與DPPH清除率線性方程為:y=543.02x+25.787，R2=0.9911。由方程計算出總固形物IC50=0.04459 mg/mL。馬蹄菜提取物與DPPH清除率線性方程為:y=33.157x+25.932，R2=0.9981。由方程計算出總固形物IC50=0.7259 mg/mL。測定沒食子酸、咖啡酸、香草酸、蘆丁、對香豆酸5種抗氧化劑對DPPH自由基的清除率，并計算出IC50。得出各抗氧化劑濃度與清除率之間線性方程分別如下，咖啡酸:y=15246x－1.0143，R2=0.9933，IC50=0.0033 mg/mL;沒食子酸:y=49340x+4.5849，R2=0.9775，IC50=0.00092 mg/mL;蘆丁:y=8238x+14.592，R2=0.9457，IC50=0.0043 mg/mL;香草酸:y=74.736x+9.116，R2=0.9282，IC50=0.5471 mg/mL;對香豆酸:y=17.437x+10.388，R2=0.9565，IC50=2.27 mg/mL。根據 IC50值越小，表示抗氧化活性越好推論可知，田基黃提取物、馬蹄菜提取物、沒食子酸、咖啡酸、香草酸、蘆丁、對香豆酸清除DPPH·能力順序為沒食子酸＞咖啡酸＞蘆丁＞田基黃提取物＞香草酸＞馬蹄菜提取物＞對香豆酸。

圖1 田基黃提取物對DPPH自由基的清除能力Figure 1 DPPH radical scavenging activity of Hypericum Japonicum Thumb extract

圖2 馬蹄菜提取物對DPPH自由基的清除能力Figure 2 DPPH radical scavenging activity of Centella Asiatica extract

2.2 對羥自由基(·OH)清除能力

按照1.2.4的方法測定田基黃、馬蹄菜提取物清除羥自由基活性的能力，以清除率對田基黃、馬蹄菜總固形物濃度作圖，實驗結果見圖3。由圖3可知，清除率隨著樣品濃度的增加而增大，根據所測定清除率及田基黃、馬蹄菜提取物總固形物濃度的關系，得出田基黃、馬蹄菜提取物濃度與清除率線性方程分別為:y=6842.1x+21.307，R2=0.9173，IC50=0.0042 mg/mL;y=4052.1x+29.463，R2=0.9394，IC50=0.0051 mg/mL 采用同樣的方法，測定蘆丁、槲皮素、山奈酚、咖啡酸對羥自由基活性的清除率，計算出IC50。各抗氧化劑濃度與清除率之間線性方程分別如下，蘆丁:y=1996.5x+3.0273，R2=0.995，IC50=0.023 mg/mL;槲皮素:y=6694.5x+31.077，R2=0.9947，IC50=0.003 mg/mL;咖啡酸:y=1252.3x+27.674，R2=0.9906，IC50=0.018 mg/mL;山奈酚:y=7735.3x+7.982，R2=0.9998，IC50=0.0054 mg/mL。從實驗結果可知，田基黃提取物、馬蹄菜提取物、槲皮素、蘆丁、咖啡酸、山奈酚清除羥自由基活性能力順序為:槲皮素＞田基黃提取物＞馬蹄菜提取物＞山奈酚＞咖啡酸＞蘆丁。

圖3 2種中草藥提取物對羥自由基的清除能力Figure 3 Hydroxyl radical scavenging activity of two kinds of herbal extracts

3 結論

田基黃、馬蹄菜的提取物都有一定的抗氧化性，尤其是田基黃提取物對DPPH自由基和羥自由基都有較強的清除作用。田基黃、馬蹄菜的提取物清除羥自由基的能力都優于山奈酚、咖啡酸和蘆丁，這為尋找天然抗氧化劑提供了一個新的來源。

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