兩個蘋果品種（Angold、HL1834）抗褐腐病研究

J.Schovánková,H.Opatová

捷克共和國化學(xué)工藝研究所食品保鮮與處理系

蘋果采后損失每年隨天氣條件、果實狀況和貯藏時間等因素發(fā)生變化。天氣條件，如冰雹，可使真菌進(jìn)入果實從而引起腐爛；收獲季節(jié)下雨，可以使某些真菌污染水果。貯藏時間長短影響著果實受感染的時間，同時果實失去其自身抗感染能力，從而產(chǎn)生腐爛。一般來說，高品質(zhì)的水果采用氣調(diào)貯藏，由于氧氣含量低真菌生長較慢所以腐爛較慢。另一方面，用于加工的質(zhì)量較差的果實是貯藏于自然條件下，其中大部分果實受到真菌侵染。有關(guān)專家研究表明，高達(dá)10%的損失可能發(fā)生在貯藏期，因而掌握引起腐爛的原因及其防治方法非常重要。仁果菌核菌、炭疽菌、鏈格孢菌、鐮刀菌、灰霉菌等是導(dǎo)致果實采后腐爛的主要病菌。

蘋果褐腐病主要通過傷口侵入，可在蘋果和梨成熟期和貯藏期侵染造成腐爛。蘋果褐腐病分生孢子可以通過風(fēng)、水、昆蟲、鳥和人進(jìn)行傳播。它引起的損傷牢固，形狀不規(guī)則，蔓延迅速，產(chǎn)生大量褐色橢圓形的分生孢子。

眾所周知，植物都具備保護(hù)自己免受真菌侵染的能力，其中一部分是產(chǎn)生酚類化合物。它們對病原感染做出反應(yīng)，促進(jìn)愈合，形成傷口保護(hù)。2001年Rivero等研究發(fā)現(xiàn)，PAL是苯丙烷類代謝途徑的主要酶，催化L-苯基丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，肉桂酸是酚類物質(zhì)合成過程中的主要中間物。PAL活性不僅與傷害或暴露于乙烯中有關(guān)，也受其他因素如溫度和真菌感染等影響。

為調(diào)查蘋果采后腐爛情況，本試驗研究了長期貯存蘋果對過成熟腐爛的反應(yīng)，對接種腐爛病菌的兩個品種的表現(xiàn)進(jìn)行了比較，其中Angold是一個很好的抗性品種，HL 1834是一個新品種。

1 材料與方法

1.1 試材 兩個蘋果品種Angold和HL 1834在10月份果實商熟期采收，貯藏在2～3°C的環(huán)境下。果實由捷克共和國holovousy研究和育種研究所提供，4月份（冷藏貯存6個月后）接種了褐腐病菌。

1.2 真菌和接種 褐腐病菌由腐爛的蘋果中提取出來，8°C在GTK瓊脂上進(jìn)行培養(yǎng)，由捷克共和國布拉格查爾斯特大學(xué)植物系鑒定，2.9×103真菌孢子利用無菌針頭接種在每個水果的兩面。每個洞深3 mm、寬4 mm，每個處理重復(fù)3次。接種后，果實在25°C貯藏4 d，然后貯藏在4℃的環(huán)境中。接種后7 d、14 d、21 d進(jìn)行分析。新鮮果實（未接種）做為對照。貯藏期間所有的監(jiān)測指標(biāo)都發(fā)生了變化。所有的參數(shù)都在長期存儲中改變，但接種后衰敗很快，因此超過21 d酚類成分變化未統(tǒng)計，僅在試驗初期對對照進(jìn)行了評估。

1.3 酚類化合物分析 Escarpa和González 2001年進(jìn)行了酚類化合物的提取和定性分析，從隨機(jī)抽取的3個蘋果中取蘋果皮1.5 g，果肉 2.5 g，及整果 2.5 g（果肉和果皮的混合物），利用80%的甲醛與BHT混合物（丁化羥基甲苯）進(jìn)行超聲振蕩2 h。提取物置于-20°C貯藏進(jìn)行分析。

利用分光光度分析法和Folin-Ciocalteu酚試劑法結(jié)合測定總酚含量，將提取物、0.5 mL Folin-Ciocalteu酚試劑、10 mL 1mol/L碳酸鈉混合，1 h后計算 750 nm的吸光率。沒食子酸作標(biāo)樣，每次處理設(shè)3次重復(fù)。利用高效液相色譜結(jié)合紫外檢測來測定酚類物質(zhì)。色譜柱：Zorbax C8(150 mm× 4 mm,5 μm)。 流動相A：0.01M 磷酸，流動相 B：0.01 mol/L乙腈-磷酸，洗脫曲線程序：5%～20%B進(jìn)行0～15 min，20%～40%B 進(jìn)行 15～20 min，40%～80%B 進(jìn)行 20～22 min，80%B 進(jìn)行 22～28 min,流速為 1 mL/min，每個處理3次重復(fù)。

1.4 苯丙氨酸解氨酶 （PAL）活性 2005年Morelló等利用改良的方法測定了PAL活性。25 g樣品 （3個蘋果果皮和果肉的混合物）與50 ml濃度為 0.1mol/L磷酸緩沖液 （pH值6.5）和1.875g聚乙烯吡咯烷酮混勻。0.4ml的上清液，4.1 ml的硼酸鈉緩沖液（pH 8.5）和1 ml L-苯丙氨酸（10 mg/ml）混勻。在 35 °C 培養(yǎng)1 h后測定吸光率，酶的活性利用每小時每克果肉釋放的肉桂酸含量（μmol）表達(dá)。每個處理設(shè)3次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用STATISTICA 9統(tǒng)計軟件 （捷克共和國布拉格市StatSoft CR有限公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)變化利用線性回歸和方差分析進(jìn)行比較（P＜0.05），Tukey 0.05 水平和Spearman相關(guān)系數(shù)測定參數(shù)之間的差異。Dunnett檢測對照和待測樣品之間的差異。

2 結(jié)果與分析

Angold和HL 1834的果皮厚度分別為69.6 μm 、59.6 μm 。 如果果皮厚度影響真菌進(jìn)入果皮的透性，那么這個參數(shù)將會很重要。2007年Blazek等研究發(fā)現(xiàn)Angold抗細(xì)菌感染，果實厚度可能是原因之一。在我們以前未公開的研究中測定了幾個蘋果品種的酚含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Angold酚類物質(zhì)含量最高，HL 1834含量最低。試驗結(jié)果也表明多酚氧化酶（PPO）和過氧化氫酶活性之間存在著顯著差異。

最初，兩個品種接種腐爛病菌后都有類似的腐爛現(xiàn)象，接種7 d后的腐爛區(qū)域直徑為3.5～4.5 cm。最后HL-1834腐爛情況很嚴(yán)重，21 d后健康組織幾乎不能分析。

2.1 總酚含量 在新鮮的果肉和果皮總酚含量分別為：Angold果肉1608±15 mg/kg，果皮5483±36 mg/kg，HL 1834 果肉 1273±21 mg/kg，果皮3582±28 mg/kg。兩個品種果皮和果肉中總酚含量存在顯著的差異 (P＜0.05)，并且2個品種果肉中總酚含量都比果皮中的低。 1998年Escarpa、González， 及2003年Tsao等試驗得出的結(jié)果與此類似。

接種后各品種表現(xiàn)出不同的反應(yīng)，與對照相比，Angold腐爛組織和正常組織周圍的總酚含量降低（P＜0.05）。而 HL 1834開始合成或釋放新的酚類物質(zhì)。與對照相比，腐爛組織果皮和果肉中的酚類物質(zhì)增加，而接種7 d后正常組織果肉酚類物質(zhì)增加（P＜0.05）。兩個品種之間的顯著差異可能與Angold本身酚類物質(zhì)比較高有關(guān)，這也可能是苯丙氨酸解氨酶和苯丙烷代謝在衰敗中未激活的原因。在幾乎所有的情況下，腐爛組織周圍酚類物質(zhì)的含量明顯比正常組織中的高。Lattanzio等在2001年也有過類似的報道。21 d后HL 1834沒有完好的果肉可供分析，因為果皮下的組織開始腐爛，試驗中也發(fā)現(xiàn)接種腐爛部位周圍的總酚含量逐漸降低。

2.2 PAL活性 采用整個蘋果(果肉和果皮)進(jìn)行PAL活性分析。結(jié)果表明，兩個品種的PAL 活性明顯不同（P＜0.05），Angold 新鮮果實PAL活性為 1.07 μmol肉桂酸/g/h ，HL 1834的為 0.75 μmol肉桂酸/g/h，PAL活性與總酚含量及所選的單個酚類物質(zhì)濃度有關(guān)。Angold隨著總酚含量的減少，PAL活性降低（P＜0.05），而HL 1834的酶活性最初增加，腐爛位置附近活性最強，但是7 d后活性降低。正常組織的PAL活性一直在緩慢增加，推斷可能由于腐爛的影響和自身防御系統(tǒng)的誘導(dǎo)產(chǎn)生了這種現(xiàn)象。腐爛組織的總酚含量和PAL活性一直在降低（P＜0.05）。

結(jié)果顯示PAL活性和總酚含量相關(guān)性密切。在接種的部分果實中，酶活性和總酚含量之間的關(guān)系r=0.71-0.99。

2.3 酚類化合物濃度 綠原酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸和根皮苷是蘋果中重要的酚類物質(zhì)，其中很多用于抗真菌方面的研究，許多專家已經(jīng)確認(rèn)了他們在蘋果抗性機(jī)理中發(fā)揮的重要作用。表1表明大量酚類化合物存在于未接種的果肉和果皮中。在測定的酚類物質(zhì)中，綠原酸是Angold品種中最重要的化合物，然而表兒茶酸、綠原酸和兒茶素是HL 1834中典型的酚類物質(zhì)，除了HL 1834中的綠原酸外，果皮中的酚類物質(zhì)含量比果肉中的高。兩個品種酚類物質(zhì)不同，可能是苯基丙烷代謝酶不同引起。

表1 新鮮樣品中的酚類物質(zhì)含量 單位：mg/kg

接種后觀察到不同的酚類化合物濃度的增加。Angold含有高水平的酚類物質(zhì)，接種7d后只產(chǎn)生了少量的酚類化合物，如咖啡酸，兒茶素、表兒茶素。如果合成其他物質(zhì)，可能也立刻改變?yōu)槠渌苌?。HL-1834中的綠原酸、兒茶素、表兒茶素主要是合成的。

品種間的差異可能是由于苯丙氨酸代謝途徑中不同酶的活性引起。2005年Morelló等和 Jones 1984年所做的試驗都表明，1-苯丙氨酸解氨酶是苯丙氨酸化合物合成過程中的第一步。

試驗結(jié)果也表明，兩個品種健康部位的PAL和綠原酸之間有很好的相關(guān)性 （r=0.98-0.99）。在腐爛部位周圍的組織中，PAL和兒茶素的關(guān)系r=0.92，PAL和表兒茶素PAL和r=0.80，僅在HL 1834中發(fā)現(xiàn)PAL和咖啡酸的關(guān)系為r=0.77。

我們可以得出這樣的結(jié)論：PAL活性不是特定酚類化合物生產(chǎn)與否的信號。苯丙烷代謝是一個復(fù)雜的過程，可能許多化學(xué)反應(yīng)同時發(fā)生，產(chǎn)生的許多化合物立即轉(zhuǎn)換成其他物質(zhì)。酚類化合物也以結(jié)合物的形式存在，如糖苷形式。它們可能會在病毒侵染、昆蟲進(jìn)食、產(chǎn)卵時通過酶或其他水解的形式釋放。因此，很難找到PAL活性和單一酚類物質(zhì)濃度之間的直接關(guān)系。

3 結(jié)論

化學(xué)物質(zhì)，尤其是參與苯丙烷代謝的酚類化合物含量和酶，都影響受病毒感染的水果的生化反應(yīng)。試驗是在商熟階段（不是過熟）進(jìn)行，目的是檢測長期儲存水果生化反應(yīng)。未成熟果實的生化反應(yīng)可能不同。我們對感染蘋果的初步研究表明，一些品種（如Angold）收獲后能夠抵抗病原體的侵入，但貯存4個月后抗真菌能力喪失。但也有些學(xué)者推斷越來越多的蘋果感染褐腐病可能與果實的成熟期及果實糖含量有關(guān)。

本研究是不同蘋果品種接種褐腐病后生化反應(yīng)的一個很好的例子，基于試驗結(jié)論，我們推斷HL 1834抗真菌能力弱，不大適合進(jìn)行有機(jī)生產(chǎn)。然而，盡管與Angold相比，該品種酚類物質(zhì)含量較低，酚類物質(zhì)不同，并且PAL活性較低，但是它的防御系統(tǒng)仍在運行，病灶的直徑與Angold接種褐腐病菌7 d后的類似，然而，其防御系統(tǒng)不足以限制病原菌的進(jìn)一步發(fā)展。必須注意的是，試驗中蘋果是被故意破壞并被接種真菌。等認(rèn)為，如果沒有損傷，果實腐爛不可能那么容易出現(xiàn)，并擴(kuò)展的那么快。同時，蘋果褐腐病菌和炭疽菌相比，是一個侵入性強的真菌。

Jones等認(rèn)為果肉和果皮中單一酚類物質(zhì)的不同可能是因為相應(yīng)酶位置的不同引起。細(xì)胞和亞細(xì)胞中相關(guān)酶的位置是決定次生代謝產(chǎn)物和最終產(chǎn)物的重要因素。確定除了綠原酸外，未發(fā)現(xiàn)PAL活性與特定酚類物質(zhì)有關(guān)。在一些文章中認(rèn)為PAL活性與酚類化合物之間存在著相關(guān)性，并且在土豆和轉(zhuǎn)基因煙草中曾報道PAL活性與綠原酸有相關(guān)性。我們可以得出這樣的結(jié)論：苯丙氨酸解氨酶的活性或其代謝受酚類化合物含量的影響，從Angold接種真菌后的反應(yīng)也能看出。可能是由于這個品種的酚類化合物含量高，病原攻擊后PAL未被激活，多酚氧化酶使酚類氧化成醌類物質(zhì)，我們在受損傷但未接種真菌的蘋果中也發(fā)現(xiàn)類似反應(yīng)，PAL活性較低，而高活性的PPO參與木質(zhì)化過程。