高爾基體膜蛋白73在原發性肝癌患者血清中的表達及其早期診斷價值

陳海波， 顧玉明， 王 洵

原發性肝癌（PHC）早期診斷率低。尋找特異性更高、更靈敏的腫瘤標志物和實驗室診斷方法是研究 PHC 的重要方向［1］。 GP73（Golgi protein-73），主要表達于人類多種組織的上皮細胞，肝細胞不表達或很少表達，而后大量研究表明：血清中GP73水平高低與PHC關系密切，在PHC檢測的靈敏度和特異度上均遠高于AFP，有望成為原發性肝癌早期診斷的腫瘤標志物［2-3］。

臨床中，布加綜合征 （BCS）合并肝細胞癌（HCC）并不少見［4-5］，二者合并發生的具體機制尚不清楚。

本研究以肝臟疾病、BCS合并HCC患者及健康志愿者為研究對象，應用電化學發光法和ELISA方法檢測各組血清中AFP值和GP73的表達水平，分別計算診斷的曲線下面積、靈敏度、特異度及正確率，探討GP73對原發性肝癌的早期診斷價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2013年3月—2014年1月在徐州醫學院附屬醫院就診的患者及健康志愿者490例。其中：① HCC 65例，男55例、女10例，年齡41～78歲，平均52歲。通過穿刺活檢、手術后病理學、DSA、B型超聲、CT中的1種或多種手段證實［6］。② 膽管細胞肝癌35例，男25例，女10例，年齡40～75歲，平均53歲。符合參考文獻［7］的診斷標準。③ BCS合并HCC 40例，男36例，女4例，年齡35～58歲，平均43歲。根據臨床表現、肝功能、腫瘤標志物、超聲、肝靜脈及下腔靜脈MRV、DSA造影及肝臟穿刺活檢等綜合確診。④乙型病毒性肝炎（乙肝）60例，男40例、女20例，年齡20～69歲，平均39歲。符合乙肝診斷標準（2010年版）［8］。 ⑤ 乙肝肝硬化60例，男39例、女21例，年齡20～70歲，平均51歲。在排除肝占位性病變后，根據臨床表現、肝功能指標檢測和B型超聲檢查等確診。⑥BCS合并肝硬化60例，男45例、女15例。年齡20～70歲，平均47歲。根據臨床表現、肝功能、B型超聲、肝靜脈及下腔靜脈MRV、DSA造影等綜合確診。⑦其他惡性腫瘤50例（胃癌20例、胰腺癌8例、食管癌10例、結腸癌2例、膽囊癌3例、直腸癌3例、十二指腸癌3例、肺癌1例），男 35例、女 15例，年齡 21～85歲，平均63歲。均獲得活檢或者手術病理學檢測證實。⑧ 肝良性病變60例（肝血管瘤40例、肝囊腫10例、肝膿腫3例、脂肪肝3例、酒精性肝病4例），男25例、女35例，年齡24～87歲，平均62歲。均經B型超聲、CT、DSA和穿刺活檢中的一種或多種手段證實。⑨收集在我院進行體檢的健康志愿者60例，男30例、女30例，年齡20～68歲，平均35歲。肝功能指標檢測正常并B型超聲檢查排除實質性占位。

1.2 方法

1.2.1 標本采集方法 抽取待檢者清晨空腹靜脈血 3 ml，室溫下自然凝集 30 min，36 000×g離心15 min，分離血清，將獲得的血清-80℃冰箱中保存，血清標本的采集均獲得受檢者的知情同意。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 ELISA法檢測血清GP73表達：取每例待檢者血清10 μl加人96孔板中，嚴格按照試劑盒（德國IBL進口分裝）說明書的要求操作，用酶聯免疫檢測儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度（A）值，每個待測血清重復2個孔。同時試劑盒中的標準品以 5 個濃度（0、5、10、20、40﹑80 ng/ml）為標準點，以標準品5個濃度為橫坐標，相應各點的A值為縱坐標繪制標準曲線，求得標準曲線公式及相關系數，后根據公式通過A值計算每例待檢者血清樣品的GP73表達水平。

1.2.2.2 血清AFP測定：采用電化學發光按照全自動Cobas601分析儀（瑞士Roche公司）的操作步驟檢測每例待檢者血清AFP水平，血清AFP水平的臨界參考值為20 ng/ml，待檢者血清AFP水平超出臨界值時，即判定為陽性。

1.3 統計學方法

應用SPSS16.0統計軟件對數據進行統計分析。由于各組樣本方差不齊，GP73和AFP水平以中位數表示，組間比較采用非參數秩和檢驗。應用SPSS16.0軟件描繪受試者工作特征（ROC）曲線，分析GP73和AFP檢測效能并確定其臨界值，根據臨界值計算GP73和AFP診斷的陽性率，以HCC患者出現AFP＞20 ng/ml或GP73＞43.40 ng/ml為真陽性，膽管細胞癌患者出現GP73＞45.40 ng/ml為真陽性，良性肝病患者陽性為假陽性；以HCC患者AFP≤20 ng/ml或GP73≤43.40 ng/ml為假陰性，膽管細胞癌患者GP73≤45.40 ng/ml為假陰性，良性肝病陰性為真陰性，判斷GP73、AFP單獨診斷HCC、膽管細胞癌的靈敏度、特異度和準確率；各組中血清GP73和AFP值間的關系采用Spearman相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組待檢血清GP73和AFP的表達水平

用于檢測血清GP73濃度的標準曲線，線性關系良好。各實驗組的GP73及AFP表達水平見表1，表2及圖1。統計分析結果顯示，HCC組、膽管細胞癌組及BCS合并HCC組患者血清GP73的表達水平顯著高于其他組 （P＜0.05）；HCC組、BCS合并HCC組患者血清AFP的表達水平顯著高于其他組（P＜0.05），膽管細胞癌組AFP的表達水平與健康體檢組差別無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組血清GP73和AFP的表達水平

表2 各組血清GP73和AFP的表達水平

圖1 各組GP73及AFP表達水平

2.2 血清GP73和AFP表達水平在HCC及膽管細胞癌中的診斷價值

分別繪制GP73和AFP的ROC曲線，當GP73取臨界值為43.40 ng/ml時，診斷HCC的靈敏度、特異度及正確率達到最佳，分別為90.8%、75.5%及77.6%，ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）為0.868；AFP取臨界值為20 ng/ml時，診斷HCC的靈敏度、特異度及正確率分別為60%、83.2%及80.2%，AUC為0.739。GP73診斷HCC的靈敏度及AUC明顯高于AFP，差異有統計學意義（P＜0.05），特異度及診斷正確率差異無統計學意義 （P＞0.05）。當GP73取臨界值為45.40 ng/ml時，診斷HCC的靈敏度、特異度及正確率達到最佳，分別為88.6%、72.7%及73.9%，AUC為0.774。結果見表3、圖 2、圖 3。

表3 血清GP73和AFP的表達水平對診斷HCC、膽管細胞癌的靈敏度和特異度及正確率 ［%（n/n）］

圖2 血清GP73及AFP診斷HCC的ROC曲線

2.3 各組待檢者血清GP73和AFP表達水平之間的關系

圖3 血清GP73診斷膽管細胞癌的ROC曲線

相關性分析結果顯示，各組待檢血清GP73和AFP表達水平之間均無相關性，HCC組r=0.018，P=0.887；膽管細胞癌組 r=-0.091，P=0.605；BCS合并HCC組r=0.061，P=0.708；乙型肝炎肝硬化組 r=-0.110，P=0.402；乙型肝炎組 r=-0.110，P=0.401；其他惡性腫瘤組 r=-0.117，P=0.373；BCS合并肝硬化組r=-0.047，P=0.747；肝良性腫瘤組r=-0.037，P=0.776； 健康志愿者組 r=-0.101，P=0.443。

3 討論

本實驗采用ELISA方法檢測490例待檢者的血清GP73水平，其血清中均能檢測到GP73的表達，且HCC、膽管細胞癌、BCS合并HCC組中GP73表達水平明顯高于其他各組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。同時，與乙肝組相比，乙肝肝硬化組GP73表達水平較高，差異有統計學意義 （P＜0.05），但AFP水平差異并無統計學意義 （P＞0.05）；BCS并肝硬化組與BCS并HCC組相比，差異有統計學意義 （P＜0.05），與乙肝肝硬化組相比，GP73及AFP水平差異均無統計學意義（P＞0.05）；Spearman相關分析發現，血清GP73與AFP的表達水平之間沒有相關性 （P＞0.05）。與AFP相比，GP73診斷肝細胞肝癌的AUC及靈敏度顯著高于AFP（P＜0.05），GP73診斷膽管細胞癌的受試者工作特征曲線下面積為0.774，靈敏度、特異度及正確率分別為88.6%、72.7%及73.9%，而膽管細胞癌組中，AFP表達水平與健康志愿者相比無明顯升高，差異無統計學意義（P＞0.05），故沒有診斷價值。

本研究發現，肝硬化組GP73水平高于乙型肝炎組，HCC組GP73水平顯著高于肝硬化組和乙型肝炎組，差異有統計學意義（P＜0.05）；顯示GP73表達水平在由乙肝向乙肝肝硬化、HCC演化過程中逐漸升高，而AFP無此趨勢變化，提示對于有乙肝、乙肝肝硬化的患者，若其血清GP73＞43.35 ng/ml，可給予其定期上腹部超聲及CT檢查，或將有助于HCC的早期診斷與治療。

BCS合并HCC組的GP73表達水平明顯高于BCS合并肝硬化組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示GP73表達水平與BCS的發生、發展所導致的淤血性肝硬化，乃至HCC過程中造成的的肝細胞損害嚴重程度較重有關，符合Iftikhar等［9］提出兩個關于GP73表達上調的機制：①是在由急性肝細胞損傷引發；②是慢性肝臟疾病的進展。提示對于BCS的患者，若其血清 GP73較高（＞43.35 ng/ml），同樣可給予其定期上腹部超聲及CT檢查，或將有助于BCS合并HCC的早期診斷與治療。

［1］ 徐海峰，楊華瑜，張宏冰，等.改變肝癌早期診斷和治療現狀的新肝癌血清標志物 ［J］.基礎醫學與臨床，2008，28：104-108.

［2］ Hu JS， Wu DW， Liang S， et al.GP73， a resident Golgi glycoprotein，is sensibility and specificity for hepatocellular carcinomaofdiagnosisin ahepatitisB-endemicAsian population［J］.Med Oncol， 2010， 27： 339-345.

［3］ Marrero JA，Romano PR，Nikolaeva O，et al.GP73，a resident Golgi glycoprotein，is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology， 2005， 43： 1007-1012.

［4］ 韓新強，祖茂衡，顧玉明，等.布-加綜合征合并肝癌36例臨床分析［J］.介入放射學雜志，2011，20： 207-209.

［5］ 魏 寧，祖茂衡，徐 浩，等.下腔靜脈膜型布加綜合征合并原發性肝癌的影像學診斷和臨床分析 （附14例病例）［C］.第六屆國際布加綜合征學術大會暨汪忠鎬血管論壇，2010：710-711.

［6］ 程永德，程英升，顏志平，等.常見惡性腫瘤介入治療指南［M］.北京：科學出版社，2013：69-73.

［7］ 中國人民共和國衛生部.原發性肝癌診療規范 （2011版）［J］.臨床腫瘤學雜志，2011，16：929-946.

［8］ 中華醫學會肝病學分會，中華醫學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南 （2010年版）［J］.中西醫結合肝病雜志，2010，21：121-122.

［9］ Iftikhar R，Kladney RD，Havlioglu N，et al.Disease-and cellspecific expression of GP73 in human liver disease ［J］.Am J Gastroenterol， 2004， 99： 1087-1095.