肝動脈灌注貝伐單抗治療大鼠肝泡狀棘球蚴病后血管內皮生長因子的動態變化

桑澤杰， 朱帝文， 紀衛政， 顧俊鵬， 張海瀟， 任偉新， 溫 浩

肝泡狀棘球蚴病（hepatic alveolar echinococcosis，HAE）中病原微生物在肝臟內具有向外突出生長特點，具有惡性浸潤的增殖方式，使該病有“第二肝癌”、“蟲癌”之稱。絕大多數患者確診時已屬晚期，手術切除率低。口服和靜脈注射阿苯達唑療效低，且不良反應嚴重［1-2］。世界衛生組織將尋找治療包蟲病其他方法列為亟待解決的重大研究課題［3］。臨床及實驗研究發現，HAE病灶及邊緣帶主要由肝動脈供血，門靜脈部分地參與供血，且與微血管密度（MVD）、血管內皮生長因子（VEGF）呈正相關［4-8］。采用介入方式經肝動脈灌注貝伐單抗（bevacizumab）是治療 HAE 的新方法［4，7-9］，但是介入栓塞術后血管再生問題困擾著介入醫師。貝伐單抗是第1個獲得美國FDA批準上市的抑制腫瘤血管生成的藥物，是VEGF的IgG1抗體，可以與之高親和性結合阻斷VEGF介導的血管生成，降低血管通透性，抑制腫瘤生長［10］。抗血管藥物的實驗研究雖然在肝癌研究中得到廣泛應用，但在HAE的治療中少見報道。本實驗基于此假設進行貝伐單抗抑制HAE大鼠血清VEGF的探索性研究，了解貝伐單抗對HAE的治療作用，為進一步研究貝伐單抗治療HAE提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取體質量 （0.20±0.05）kg的SPF級Wistar雌性大鼠［新疆醫科大學實驗動物中心供給， 合格證號： FYXK（新）2003-0001］，參照相關文獻制作Wisar大鼠的HAE動物模型［11］。用超聲診斷和篩查大鼠HAE的感染狀況，并證實HAE在大鼠肝實質內成功接種［12］。選取非鈣化型HAE。

1.1.2 器材 氯胺酮、地西泮、阿托品、GE超聲診斷儀、EMS切片機、無水乙醇（分析純）、甲醛溶液（分析純）、貝伐單抗（bevacizumab，商品名 Avastin，美國Roche公司）。人VEGF檢測試劑盒（武漢博世德生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法

1.2.1.1 實驗準備：參照相關文獻配制Wistar大鼠麻醉藥物，把氯胺酮、地西泮、阿托品按1∶1∶0.5配伍，并用0.9%氯化鈉溶液按1∶1配制并稀釋麻醉藥物，按7 ml/kg行腹腔麻醉給藥，麻醉大鼠后背，脫毛并仰臥固定在鼠板上，參照外科標準手術腹部備皮并常規消毒、鋪巾，手術刀在劍突下1 cm略偏左切3～5 cm縱行切口，逐層切開皮膚入腹并游離腸管，暴露HAE病灶及大鼠腹腔干動脈。視野范圍內保持清晰，并在直視下超選擇性植入自制導管在肝動脈內部備用。

1.2.1.2 分組及處理：HAE種植6個月后行超聲檢查，40只成功接種HAE，病灶直徑達（1.0±0.2）cm，隨機分成空白對照組和實驗組，分別經肝動脈灌注0.9%氯化鈉溶液和貝伐單抗。術后兩組結扎肝固有動脈，分別于術后7、14、21和28 d鼠尾靜脈取血，在最后1 d取HAE組織緣帶標本，將所得標本常規置甲醛中固定48 h，石蠟包埋，連續4 μm切片（每份標本5張），脫蠟、染色，在光鏡下觀察HAE病理組織。光鏡下觀察病理切片依據大鼠泡球蚴角質層、生發層的病理學形態改變及育囊發育情況分為3級［13］。 0級（基本正常）：泡狀棘球蚴結構基本正常，多數見育囊或芽生結構，育囊內有數量不等的原頭節，鈣顆粒形態正常。Ⅰ級（變性改變）：泡狀棘球蚴結構存在，角質層和生發層可辨認，組織普遍變性腫脹，很少見育囊和原頭節。Ⅱ級（壞死）：泡狀棘球蚴結構失常，生發層細胞核固縮、溶解或消失，育囊與原頭節少見。偶見鈣顆粒，形態模糊。重者有纖維組織增生和炎性細胞浸潤。

1.2.2 血清學及病理學檢測

1.2.2.1 血清VEGF檢測：采用酶聯免疫吸附法（ELISA）法檢測血清VEGF，在反應孔加入稀釋液，每孔加入50 μl標準品或樣品，于空氣恒溫搖床上孵育2 h。倒出微孔板中液體，每孔加入400 μl沖洗緩沖液后倒出，再加入沖洗緩沖液，反復洗滌4次。每孔加入200 μl VEGF結合物孵育2 h后洗滌。每孔加入200 μl基質溶液，孵育30 min。加底物液顯色后終止反應。血清VEGF放在ELISA檢測儀上，于450 nm處，用空白的對照孔調零點后測各孔吸光度（A）值，A值經過Curve Expert處理獲得標準曲線和回歸方程繪制標準曲線，并通過標準曲線 讀出待測樣本的濃度。

1.2.2.2 肝功能檢測：檢測兩組大鼠治療前后的肝功能各項指標。

1.3 統計學處理

采用SPSS17.0軟件包進行統計學分析。計量資料數據用表示，若資料服從正態分布，各組方差齊，采用方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠HAE的病理改變

實驗過程中，對照組死亡2只，實驗組死亡1只。在藥物灌注后第28天，對照組病理變化以0級（基本正常）為主（9/18），光鏡下可見泡狀棘球蚴結構基本正常，囊壁生發層、角質層生長良好；Ⅰ級（變性）7只，Ⅱ級（壞死）2只，光鏡下角質層、生發層模糊，部分生發層細胞核溶解。實驗組以Ⅰ級（變性）為主（11/19），光鏡下可見泡狀棘球蚴結構失常，角質層、生發層普遍變性、分離或斷裂、脫落，皮層變薄，部分結構被破壞，囊泡內原頭節變形、崩解。肝細胞可見少量變性、壞死和纖維組織增生；0級（基本正常）改變6只，Ⅰ級（變性）改變2只。

2.2 肝動脈灌注貝伐單抗對肝功能的影響

術后第7天，實驗組天冬氨酸轉氨酶（AST）為（169.21 ± 7.71）u/L，丙氨酸轉氨酶（ALT）為（44.21 ±2.08）u/L， 與對照組分別為 （167.21 ± 4.27）u/L、和（46.15±3.04）u/L比較，差異無統計學意義 （P＞0.05）。此后，實驗組AST和ALT水平逐漸下降，第14天時略高于正常水平，AST為 （119.41±7.21）u/L，ALT 為 （38.53 ± 2.31）u/L， 而 對 照組 AST 為（115.41 ± 5.35）u/L，ALT 為（37.13 ± 2.42）u/L，組間差異無統計學意義 （P＞0.05）（圖1、2）。 實驗組第21、28天 AST分別為（106.41± 5.25）u/L 和（106.32±4.25）u/L，ALT 分別為 （32.53 ± 3.24）u/L 和 （33.47 ±3.04）u/L，恢復至正常水平，而對照組AST分別為（105.32 ± 7.33）u/L 和（104.21 ± 2.26）u/L，ALT 分別為（33.32 ± 2.31）u/L 和（32.12± 3.34）u/L，組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 血清VEGF表達

對照組和實驗組手術前、后的VEGF表達見表1。

圖1 兩組術前及術后天冬氨酸轉氨酶的變化

圖2 兩組術前及術后丙氨酸轉氨酶的變化

表1 兩組大鼠手術前、后的VEGF表達

表1 兩組大鼠手術前、后的VEGF表達

注：與術前及對照組比，aP＜0.05；與術后28 d比bP＜0.05

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3 討論

開腹注射HAE造模要有肝細胞增生和肝硬化背景。HAE以肝動脈供血為主，而且全身免疫系統未被徹底破壞，因此與人體原發性HAE的臨床情景較相似［14-15］。HAE血管造影動脈期表現為動脈增粗、迂曲、包繞，呈“手握球”征象［4］；在毛細血管期可見病灶呈環行染色，中央區無染色。間接門脈造影表現可見由于腫塊效應所致的門脈分支受壓推移改變。HAE病灶與周圍肝組織間邊緣浸潤帶區域血流灌注高于病灶內部及周圍肝臟組織，CT灌注成像及成像參數與微血管密度 （MVD）、VEGF-a呈正相關，大鼠HAE病灶對周邊肝組織是以擠壓及壓迫為主，主要表現為缺氧、缺血的病理表現，周邊浸潤增殖區存在豐富的微血供，且HIF-1α與CD34均呈高表達狀態，與超聲造影后的環狀增強區與MVD的結果一一對應［8，16］。 實驗組術后 2、3 周血清 VEGF表達持續下降，與術前及對照組相比，術后4周恢復，與文獻報道一致，說明血清VEGF在術后得到持續抑制。我們推測，HAE病灶邊緣帶的豐富血供與血清VEGF高表達呈正相關，而HAE病灶內部血供的缺失與VEGF低表達相一致，仍需進一步研究證實。

貝伐單抗是人工合成的針對VEGF的IgG1型單克隆抗體，特異性與內皮細胞VEGF上的受體信號結合［10］，阻斷 MAPK/ERK通路，以及上調 Bax/Bc-l 2比率，抑制VEGF的抗凋亡作用而促進凋亡，破壞新生血管內皮細胞，阻斷邊緣帶營養供應而“殺死”HAE，同時對正常血管幾無影響，對正常肝細胞也無影響。根據Folkman等［17］的理論，當腫瘤局部乏氧時，腫瘤血管的生長一方面依賴于腫瘤細胞釋放血管生長因子激活血管內皮細胞的增殖和遷移；另一方面內皮細胞旁分泌血管生成促進因子刺激腫瘤細胞的生長，尤其是VEGF在其中起著極其重要的調節作用［6］。HAE病灶與周圍肝組織間邊緣浸潤帶高表達MVD和VEGF。抗血管生成藥物能下調體內的促血管生成因子，上調體內的血管生成抑制因子，通過改變血管生成調節因子的平衡關系，發揮抗血管生成作用［7-8］。本實驗將貝伐單抗肝動脈給藥，相對于靜脈給藥既經濟，又減低對機體的影響，而且貝伐單抗可從分子水平抑制血管新生，使血管內皮細胞休眠、衰老或凋亡，以間接抑制HAE邊緣帶細胞的生長。我們通過建立大鼠HAE模型并行選擇性肝動脈灌注術，發現術后HAE血清VEGF明顯下降，尤以術后7 d最為明顯，術后28 d又恢復至原有水平。病理學結果表明，HAE病灶病理改變及病灶大小不明顯，邊緣帶組織VEGF表達情況需進一步探究。本實驗尚不能證明血清VEGF與HAE轉移及預后關系。

從目前已進行的相關實驗研究發現，介入治療HAE可在較短時間內從病理學角度觀察到泡球蚴組織發生變性、壞死［7，9，18］，說明通過介入技術治療HAE是切實、可行的。貝伐單抗經肝動脈灌注治療大鼠HAE的實驗表明，貝伐單抗可明顯減緩HAE的VEGF表達，因為VEGF主要在缺氧的細胞及其周圍基質細胞中表達，貝伐單抗不僅破壞了HAE組織細胞本身，還破壞了HAE賴以生存的微環境，從而抑制HAE的迅速生長，但是單純采用貝伐單抗不能殺死HAE，只能延緩生長速度，因此，聯合阿苯達唑治療將是下一步研究的重點。

［1］ Ammann RW，Hirsbrunner R，Cotting J，et al.Recurrence rate after discontinuation of long-term mebendazole therapy in alveolar echinococcosis （preliminary results）［J］.Am J Trop Med Hyg， 1990， 43： 506-515.

［2］ Nourbakhsh M，Shemshaki H，Zarezadeh A，et aI.Recurrent hydatosis at the site of non-union humerus fracture［J］.Int J Prev Med，2012，3：660–663.

［3］ Reittner P， Szolar DH， Schmid M.Case report.Systemic manifestation of Echinococcus alveolaris infection ［J］.J Comput Assist Tomogr， 1996， 20： 1030-1032.

［4］ 任偉新，肖湘生，陳 鵬，等.肝泡狀棘球蚴病的DSA表現及介入治療［J］.介入放射學雜志， 2004， 13： 496-498.

［5］ 任偉新，肖湘生.肝泡狀棘球蚴病門脈血供的實驗研究［J］.中國介入影像與治療學，2007，4：142-147.

［6］ 樊玉祥，任偉新，迪理木拉提·巴吾冬，等.DSA評價大鼠肝泡狀棘球蚴病血供 ［J］.中國介入影像與治療學，2012，01：37-40.

［7］ 朱帝文，穆 民，任偉新，等.經門靜脈藥物灌注化療栓塞治療大鼠肝泡狀棘球蚴病的電鏡觀察 ［J］.介入放射學雜志，2013， 22： 674-677.

［8］ 王 靜，任 波，劉文亞，等.肝臟泡球蚴病CT灌注成像與微血管密度及血管內皮生長因子的相關性分析［J］.中華放射學雜志，2011，45：1036-1039.

［9］ 樊玉祥，任偉新，迪力木拉提·巴吾冬，等.阿苯達唑微球肝動脈灌注對大鼠肝泡狀棘球蚴病的治療作用［J］.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2011，06：415-418.

［10］ Zhang W， Fulci G， Buhrman JS， et al.Bevacizumab with angiostatin-armed oHSV increases antiangiogenesis and decreases bevacizumab-induced invasion in U87 glioma［J］.Mol Ther， 2012， 20： 37-45.

［11］張金輝，溫 浩.原發性肝泡球蚴動物模型的建立 ［J］.中國局解手術學雜志，2000，9：11-13.

［12］朱帝文，任偉新，顧俊鵬，等.超聲在篩檢大鼠肝泡狀棘球蚴病模型中的應用價值 ［J］.中國醫學影像技術，2009，25：363-365.

［13］陸永綏，李清華，張偉明.臨床檢驗自動化分析儀器標準化操作規程［M］.杭州：浙江大學出版社，2006：9-15.

［14］ Rajewsky MF，Dauber W， Frankenberg H.Liver carcinogenesis by diethhylnitrosamine in the rat［J］.Science， 1966， 152： 83-85.

［15］ Liu YF， Zha BS， Zhang HL， et al.Characteristic gene expression profiles in the progression from liver cirrhosis to carcinoma induced by diethylnitrosamine in a ratmodel［J］.J Exp Clin Cancer Res， 2009， 28： 107.

［16］ Tao S，Qin Z，Hao W，et al.Usefulness of gray-scale contrastenhanced ultrasonography （SonoVue?） in diagnosing hepatic alveolar echinococcosis ［J］.Ultrasound Med Biol， 2011， 37：1024-1028.

［17］ Folkman J，MERLERE，Abernathy C，et al.Isolation of atum or factor responsible to angiogenesis ［J］.J Exp Med， 1971， 133：275-288.

［18］桑澤杰，朱帝文，紀衛政，等.射頻消融治療大鼠肝泡狀棘球蚴病及病理改變［J］.介入放射學雜志，2014，01：58-61.