糖尿病大鼠骨髓來源內皮祖細胞體外生物學活性研究

魏黎明， 付銀鑫， 朱悅琦， 魯海濤， 王 玨， 程永德， 李曉聰，汪 泱， 趙俊功

內皮祖細胞 （endothelial progenitor cells，EPC）是一種骨髓來源的多能干細胞，因其具有修復損傷血管內皮層及生成新生血管作用，EPC在糖尿病血管系統并發癥、腦卒中等缺血性疾病領域中的研究越來越多［1-2］。已有學者指出外周血EPC功能失調可能降低糖尿病患者的血管再生能力，糖尿病患者支架植入出現內皮化亦會延遲［3-4］。但對EPC在糖尿病患者或動物骨髓中的變化目前研究較少，是否也存在功能受損有待于進一步研究［5-6］。本研究探討糖尿病大鼠骨髓來源EPC與正常大鼠在數量及生物學活性方面的差異，為提高糖尿病患者下肢血管病變介入治療后的長期通暢率提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 糖尿病大鼠模型的建立

雄性SD大鼠10只，SPF級，體重250～350 g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證編號：SCXK（滬）2008-0016。將大鼠隨機分為糖尿病組和對照組各5只。按說明書配置溶解（STZ，Sigma）的枸櫞酸緩沖液，實驗組大鼠禁食12 h后按60 mg/kg腹腔快速注射含1%STZ的枸櫞酸緩沖液。對照組大鼠腹腔注射等量的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。48 h后快速血糖儀檢測大鼠隨機血糖水平判定是否建模成功，判定標準為隨機血糖濃度＞16.7 mmol/L，每周測定1次大鼠血糖水平及體重，直至實驗結束全部處死。

1.2 EPC的分離和培養

大鼠骨髓來源EPC的分離、培養和鑒定方法按參考文獻［7］。用PBS反復沖洗大鼠股骨和脛骨骨髓腔，梯度離心分離單個核細胞 （MNC），提取云霧狀細胞層，加入EGMTM-2MV Bullet KitTM培養基（VA，USA），計數并調整細胞濃度后種入預先包被纖維連接蛋白 （Gene Operation，USA）的 6孔板，置于37℃、體積分數為0.05的CO2飽和濕度培養箱中培養，4 d后首次換液，去除未貼壁細胞，以后每3～4 d換液1次。細胞融合約90%進行傳代。

1.3 EPC的鑒定及生物活性測定

1.3.1 流式細胞儀檢測 EPC培養8 d后，重懸于含0.5%BSA的PBS，離心，4%多聚甲醛固定，BSAPBS再次重懸并分管，分別加入抗體CD34（R&D system，USA）、CD13 （Anti-PROM1 pAb，Abnova，USA）及血管內皮生長因子受體2（VEGFR-2，Abcam，USA），室溫孵育30 min，加入各自配對二抗，室溫避光孵育1 h后上流式細胞儀檢測。

1.3.2 攝取Dil-Ac-LDL與結合FITC-UEA-1實驗 取培養8 d的EPC，吸棄孔內液體，加入Dil-Ac-LDL（10 mg/L，Bicycle Technologies International，USA），置于培養箱中孵育4 h，以4%多聚甲醛固定后加入 FITC-UEA-1（10 mg/L，Sigma），繼續置于培養箱中孵育1 h，以PBS漂洗后加入DAPI（Abcam，USA）染色，置于免疫熒光顯微鏡觀察并拍照。能夠同時攝取Dil-Ac-LDL與結合FITC-UEA-1的細胞被認為是正在分化的EPC。計數10個隨機100倍視野的貼壁細胞，比較糖尿病大鼠骨髓來源EPC數量與正常大鼠的差異。

1.3.3 EPC黏附能力檢測 0.25%胰蛋白酶消化原代EPC后重懸并接種于纖維連蛋白預包被的培養板中，培養箱孵育30 min，計數10個隨機200倍視野的貼壁細胞。

1.3.4 EPC增殖能力檢測 將原代EPC重懸細胞液轉至96孔板，糖尿病組和對照組分別設計35個含細胞副孔，并設置7個無細胞副孔作空白對照，每孔約3 000個細胞，連續7 d，每天檢測5個細胞孔及1個副孔的EPC增殖能力，檢測時每孔加入CCK-8 試劑（Yeasen，China）后培養箱孵育 3 h，細胞上液轉至另一96孔板，于酶標儀450 nm處測吸光度（A）。

1.3.5 EPC遷移能力測定 Transwell小盒（Corning，USA）膜底層提前包埋纖維連接蛋白2 h，原代EPC不含血清基礎培養基重懸，上室加入100 μl細胞懸液，約3 000個細胞，下室加入700 μl含血清培養基，放置培養箱孵育14 h后吸取上室懸液，4%多聚甲醛1 ml固定30 min，棉簽棒小心擦掉上層細胞，DAPI染色3 min，晾干，在免疫熒光顯微鏡下計數10個隨機200倍視野的貼壁細胞。

1.4 統計學方法

應用SPSS20.0軟件進行統計學分析，所有數據以均數 ±標準差表示，組間比較采用成組t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糖尿病組和對照組大鼠血糖、體重變化

糖尿病組大鼠腹腔注射STZ后，逐漸出現多尿、多飲、多食、體重增速減緩，而對照組大鼠生長發育正常。注藥后每周檢測兩組大鼠血糖水平及體重。糖尿病組大鼠血糖明顯升高，體重增長速度明顯減緩（圖1），注射STZ后48 h血糖即明顯升高，從（5.11 ± 0.35）mmol/L 升至（27.6 ± 3.34）mmol/L，此后一直維持高血糖狀態，而對照組大鼠血糖一直維持正常值水平。另外，糖尿病組大鼠體重增速明顯降低，2個月后體重從 （246.2±7.6）g升至（291.7 ± 13.7）g， 而對照組體重從 （251.1 ± 10.2）g升至（361.7 ± 16.2）g。

2.2 EPC形態學變化

兩組大鼠EPC細胞形態無明顯差異，剛分離的MNC均呈小圓形，約在培養4 d左右出現部分圓形細胞伸開突起，呈短梭形貼壁，形成細胞集落，細胞形態逐漸拉長，8 d后細胞生長旺盛，已較為密集，可見紡錘形、三角形等不同形態細胞，12 d左右細胞可完全鋪滿板孔，形態為梭形，呈“鋪路石”樣（圖2，3）。

2.3 EPC鑒定

圖1 注射尿鏈佐菌素后糖尿病組大鼠體重增長速度明顯減緩（上圖），血糖明顯升高，且保持穩定狀態（下圖）

圖2 糖尿病大鼠EPC培養過程中的形態變化（×100）

圖3 對照組大鼠EPC培養過程中的形態變化（×100）

2.3.1 CD34、CD133和 VEGFR-2表達 經過 8 d培養的EPC固定后行免疫組化流式細胞術檢測，結果顯示兩組CD34、CD133及VEGFR-2均呈陽性，陽性率占85%以上（圖4）。

2.3.2 攝取Dil-Ac-LDL與結合FITC-UEA-1實驗 免疫熒光顯微鏡下，EPC攝取Dil-Ac-LDL后胞質呈紅色，結合FITC-UEA-1的胞質呈綠色，DAPI染色細胞核呈藍色 （圖5）。計數10個隨機100倍視野的貼壁細胞。糖尿病組大鼠EPC數目為（102.2 ± 6.8）個，對照組大鼠為（105.6 ± 8.0）個，組間差異無統計學意義 （P＞0.05）。兩組EPC培養24 d時，大部分細胞的Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1雙染色仍呈雙陽性。

圖4 流式細胞儀檢測糖尿病組（上排）和對照組大鼠（下排）EPC表面標志CD34、CDl33及VEGFR-2表達均呈陽性

圖5 EPC的DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1雙染法鑒定（×400）

2.3.3 EPC黏附、增殖及遷移能力檢測 取培養12 d的EPC作細胞生物功能測定，消化重懸后接種于培養板，30 min后置于倒置顯微鏡下隨機采集10個200倍視野，并計數視野內貼壁細胞數量，糖尿病組和對照組EPCs貼壁細胞數目分別為 （16.7±2.2）個和（23.3±4.9）個，組間差異有統計學意義（P＜0.05），提示糖尿病組EPC黏附能力較對照組減少。從圖6可見，連續7 d的A值表明對照組EPCs細胞活力高于糖尿病組，且活度保持較穩定，而糖尿病組EPC活力開始較低，隨后有逐漸上升趨勢，但仍較對照組細胞活度低，由此可見糖尿大鼠EPC增殖能力亦較正常大鼠減弱。14 h后經DAPI染色可見，糖尿病組和對照組細胞數目分別為（12.9±4.2）個和（17.1±6.1）個，組間差異有統計學意義（P＜0.05），提示糖尿病大鼠EPC遷移能力較正常大鼠亦減弱。

圖6 兩組大鼠EPCS增殖能力比較

3 討論

EPC是一種來源于骨髓并可被動員進入外周血循環、具有分化為內皮細胞能力的干細胞，在血管損傷后受損，骨髓內的EPC可被動員入外周血并聚集至損傷部位黏附并分化為成熟的EPC，參與血管內皮化［7］。外周血的EPC數量下降，功能亦受損，包括氧化應激作用、NADPH氧化酶激活以及PI-3激酶/Akt通路激活失靈等［8-10］。相對于外周血，骨髓中的EPC含量是外周血的10～15倍，且增殖能力更強［11］，而骨髓是外周血EPC的來源，研究骨髓來源EPC的性質及功能對于揭示外周血EPC數量及功能下調具有重要意義。

本研究中，我們發現糖尿病大鼠EPC與正常大鼠在細胞形態上無明顯區別，早期為短梭形或三角形貼壁多見，生長速率較慢，至第8天后生長速率明顯增快，12 d左右即可鋪滿培養板，細胞逐漸呈長梭形改變，且逐漸增多，呈鋪路石樣外觀，邊界輪廓光滑，早期短梭形細胞逐漸少見。

EPC表面抗原標志物主要有造血譜系（CD34和 CD133）及內皮譜系（VEGFR-2，CD31 和 vWF）。一般認為，骨髓來源的早期EPC或者剛動員至血液循環的EPC通常表達 CD133、CD34和 VEGFR-2，而外周血的EPC主要表達CD34、VEGFR-2、CD31、VE-cadherin及vWF，隨著EPC分化成熟，細胞逐漸喪失表達 CD133的能力，而開始表達vWF［12］。 目前認為主要通過CD34、CD133和VEGFR-2三種表面抗原鑒定EPC。本實驗中，糖尿病和正常大鼠的EPC均培養至8 d后鑒定CD34、CD133和VEGFR-2，三者陽性率均大于85%，與之前報道結果相符，CD133仍呈高表達，提示其為早期未成熟的EPC。

EPC功能減退是糖尿病血管并發癥發生的重要原因，正常情況下局部血管出現損傷或組織缺血后會釋放生長因子，生長因子會促使骨髓EPC增殖并形成細胞集落，當骨髓EPC被動員至外周循環血管系統損傷處時可黏附至成熟的內皮表面，促進再內皮化及新生血管生成［13］。由于糖尿病引起的全身系統的病理生理變化，可導致EPC各項功能衰弱，以至血管損傷處內皮化不全，傷口愈合及新生血管速率減慢。

［1］ Chen J， Chen J， Chen S， et al.Transfusion of CXCR4-primed endothelial progenitor cells reduces cerebral ischemic damage and promotes repair in db/db diabetic mice ［J］.PLoS One，2012， 7： e50105.

［2］ Tatsumi T， Matsubara H.Therapeutic angiogenesis for peripheral arterial disease and ischemic heart disease by autologous bone marrow cells implantation ［J］.Nihon Rinsho， 2006， 64： 2126-2134.

［3］ Zhang W， Yan H.Dysfunction ofcirculating endothelial progenitor cells in type 1 diabetic rats with diabetic retinopathy［J］.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol， 2013， 251： 1123-1131.

［4］ Pendyala LK， Yin X， Li J， et al.The first-generation drugeluting stents and coronary endothelial dysfunction ［J］.JACC Cardiovasc Interv， 2009， 2： 1169-1177.

［5］ Murayama T，Tepper OM，Silver M， et al.Determination of bone marrow-derived endothelial progenitor cell significance in angiogenic growth factor-induced neovascularization in vivo［J］.Exp Hematol， 2002， 30： 967-972.

［6］ 肖 亮，申 景，黃德生，等.糖尿病下肢動脈阻塞性病變介入治療療效分析［J］.介入放射學雜志，2011，20：218-223.

［7］ Massa M， Rosti V， Ferrario M， et al.Increased circulating hematopoietic and endothelial progenitor cells in the early phase of acute myocardial infarction［J］.Blood， 2005， 105： 199-206.

［8］ Sukpat S， Isarasena N， Wongphoom J， et al.Vasculoprotective effects of combined endothelial progenitor cells and mesenchymal stem cells in diabetic wound care：their potential role in decreasing wound-oxidative stress ［J］.Biomed Res Int， 2013，2013： 459196， doi： 10.1155/2013/459196.

［9］ Liu J， Zhang FF， Li L， et al.ClC-3 deficiency prevents apoptosis induced by angiotensinⅡin endothelial progenitor cells via inhibition of NADPH oxidase［J］.Apoptosis， 2013， 18：1262-1273.

［10］ Aicher A，Heeschen C，Mildner-Rihm C，et al.Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor cells［J］.Nat Med， 2003， 9： 1370-1376.

［11］ Hasegawa T， Kosaki A， Shimizu K， et al.Amelioration of diabetic peripheral neuropathy by implantation of hematopoietic mononuclear cells in streptozotocin-induced diabetic rats［J］.Exp Neurol， 2006， 199： 274-280.

［12］ Rustemeyer P， Wittkowski W， Jurk K， et al.Optimized flow cytometric analysis of endothelial progenitor cells in peripheral blood［J］.J Immunoassay Immunochem， 2006， 27： 77-88.

［13］ Kim KA， Shin YJ， Kim JH， et al.Dysfunction of endothelial progenitor cells under diabetic conditions and its underlying mechanisms［J］.Arch Pharm Res， 2012， 35： 223-234.