冷循環射頻消融治療后肝癌患者調節性T細胞變化及其對預后的影響

曾江正， 劉光清， 郝新寶， 洪 濤， 張建輝， 蘇群豪，黃美珠， 黃 芬， 雷俊華

肝癌（HCC）發病隱匿，僅有10%～20%的患者有機會接受手術根治性治療［1］。 射頻消融（RFA）治療已成為無法切除的中晚期HCC主要的局部治療方法［2］。相關研究表明，經高溫作用滅活后的腫瘤組織由于其細胞免疫表型的變化而具有瘤苗作用，從而激活機體免疫反應［3］。 調節性 T（regulatory T，Treg）細胞是一群能抑制免疫功能的負調控細胞，近年來Treg細胞己經成為腫瘤免疫學的熱點問題之一。本研究通過冷循環RFA治療HCC患者，了解RFA治療對HCC患者Treg細胞水平的影響，同時探討Treg細胞水平變化對HCC患者預后的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 2009年10月—2012年6月我院腫瘤內科HCC患者30例，男19例，女11例；年齡32～65歲，中位年齡51歲；初治23例，手術后復發7例；腫瘤癌灶最大直徑（2.5±1.2）cm（2.1～5.0 cm）；Child-Pugh A級 18例，B級 12例；所有患者術前未接受TACE或化療，隨訪期間未使用影響免疫調節藥物。入組標準：①病理活檢證實為HCC；② 腫瘤數目 ≤3個且最大癌灶直徑 ≤5.0 cm；③腫瘤有包膜或邊界清晰，腫瘤距肝邊緣具有足夠滅瘤安全范圍者；④ 肝功能Child-Pugh A級或B級，無肝外轉移。排除標準：①腫瘤數目＞3枚或最大癌灶直徑 ＞5 cm，或者彌漫型HCC；② 伴有門脈癌栓或者鄰近器官侵犯；③肝功能Child-Pugh C級，經保肝治療無法改善者；④治療前1個月內有食管（胃底）靜脈曲張破裂出血；⑤不可糾正的凝血功能障礙及嚴重血象異常，有嚴重出血傾向者；⑥ 頑固性大量腹水，惡液質；⑦ 活動性感染；⑧ 嚴重的肝、腎、心、肺、腦主要臟器功能衰竭；⑨ 意識障礙或不能配合治療的患者。所有患者于RFA術前均簽署治療同意書。

1.1.2 儀器設備 江蘇天馬高科技有限責任公司生產TM-RFTI-1冷循環RFA治療系統。包括射頻源、蠕動泵、冷循環電極、中性電極板。穿刺引導機為Philips HD11超聲儀。應用日本ALOKA α10彩色多普勒超聲（彩超）顯像儀，采用Bracco公司超聲對比劑Sono Vue，造影微泡為磷脂包裹的六氟化硫微氣泡。采用美國Bectond-Dickinson公司生產的FACSCalibur型流式細胞儀 （FCM）及抗 CD3-PerCP、抗 CD25-PE、抗 CD4-FITC及同型對照，CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4APC T細胞亞群試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 RFA方法 術前行常規彩超或超聲造影檢查，確認腫塊的部位、大小、數目、邊緣、血供情況及毗鄰臟器。術前禁食6 h，術前15 min予哌替啶50 mg、非那根25 mg肌內注射。術中采用曲馬多300 mg靜脈滴注維持止痛，穿刺點采用2%利多卡因局麻，對于有慢性呼吸道疾病的患者術前加服可待因0.3 mg預防術中突發咳嗽，術中心電監護并準備好搶救用品。

制訂方案：直徑＜3 cm的病灶采用一針穿刺，一點消融；直徑＞3 cm的病灶采用多針穿刺，多點消融的空間布針方案，多點消融的順序是先消融深部的腫瘤再消融表淺的腫瘤，治療范圍力求完全覆蓋病灶并超出病灶周邊1.0～2.0 cm，最大限度地毀損病灶。右肝病灶一般從右腋前或右腋中線進針，左肝病灶一般從左肋弓內側進針。彩超確認射頻電極位置準確后先開啟冷循環泵，然后選擇阻抗模式進行RFA治療，每個位點治療時間設為12 min，然后根據病灶情況調整電極位置進行多次穿刺追加治療，拔針時手動模式35 W緩慢退針進行針道消融。

1.2.2 FCM檢測 新鮮采集的50 μl肝素抗凝血2份，分別加入抗CD3-PerCP/抗CD4-FITC/抗 CD25-PE單克隆抗體及抗CD3-PerCP/抗CD4-FITC單克隆抗體/小鼠 IgG1-PE各 15 μl，室溫避光孵育20 min，加入2 ml溶血素，室溫避光 10 min，1 000 r/min×5 min離心后棄上清液，加入 PBS 2 ml洗滌1次，1 000 r/min×5 min離心后棄上清液，加入PBS 250 μl，上機使用 CELL Quest軟件進行檢測，選擇熒光強度 ＞100的CD4+CD25+作為Treg細胞，記錄陽性細胞百分率，減去非特異性對照值。檢測冷循環RFA治療前、治療后1、4、7和12個月后外周血調節性T細胞變化。Treg谷值為RFA治療后每例患者外周血Treg百分率降低所達到的最低值。Treg達谷時間為從治療開始至外周血Treg百分率降低所達到的最低值水平的時間（單位：月）。

1.2.3 療效評價 治療后1個月行增強CT或超聲造影檢查，評價病灶消融效果。參照2011年肝癌局部消融治療規范的專家共識［4］，腫瘤緩解（TR）包括：① 完全消融（CR），指肝臟三期CT或者超聲造影隨訪，腫瘤所在區域為低密度（超聲表現為高回聲），動脈期未見強化；② 不完全消融（ICR），指肝臟三期CT或者超聲造影隨訪，腫瘤病灶內局部動脈期有強化，提示有腫瘤殘留。對治療后有腫瘤殘留者，可以進行再次消融治療，若兩次消融后仍有腫瘤殘留，則確定為消融治療失敗，應該選用其他治療手段。③ 腫瘤進展（TP），局部腫瘤進展（local tumor progression），指腫瘤完全消融后，在消融灶邊緣出現新病灶，新病灶與消融灶相連；新病灶（new lesion），指肝內其他部位新發生的病灶；遠處轉移（distant metastasis），指出現肝外的轉移灶。無進展生存期隨訪終點為治療后腫瘤進展或者隨訪時間滿12個月。如果腫瘤進展，及時換用其他方案治療。

1.3 統計方法

數據采用SPSS13.0統計軟件進行統計處理。計量資料Treg、Treg谷值經探索性分析，均服從正態分布，采用成組及配對t檢驗。采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）及Kaplan-Meier生存函數的方法分析Treg細胞水平動態變化與腫瘤無進展生存期的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Treg細胞與RFA療效的關系

30例患者共用42支電極針，其中集束針4支。治療后1個月行增強CT或超聲造影檢查示30例患者TR率 93.3%（28/30），其中CR 21例，PR 7例，PR行第2次補充消融治療成功，TP率6.7%例（2/30）。RFA術前Treg（9.42±1.16）%， 術后1個月（6.55 ±0.97）%， 較術前顯著下降 （t=15.325，P ＜0.01）。 經 12個月隨訪，TR 率 33.3%（10/30），TP 率66.7%例（20/30）。TR、TP組術前 Treg分別為（8.75±0.72）%、（9.76 ±1.20）%，兩組比較差異有統計學意義 （t=-2.448，P=0.021）， 提示RFA術前較低的Treg細胞值有較好的臨床療效。見圖1、2。

圖1 TR組CD4+CD25+Treg細胞

圖2 TP組CD4+CD25+Treg細胞

2.2 Treg細胞水平動態變化與腫瘤無進展生存期的關系

采用ROC曲線的方法尋找Treg谷值、Treg達谷時間判斷RFA術后肝癌患者腫瘤進展情況最優化的臨界值水平。研究結果表明，Treg谷值及Treg達谷時間的曲線下面積（AUC）分別為0.795±0.084（P=0.009）、0.880 ± 0.061（P=0.001），說明兩者對于預后判斷具有一定程度上的準確性。Treg谷值以4.82%為最佳臨界值時，靈敏度為90.0%，特異度為60.0%。Treg谷值大于4.82%提示預后欠佳。對于Treg達谷時間，5.5個月為最佳臨界值，靈敏度為70.0%，特異度為85.0%。達谷時間大于5.5個月的患者預后更佳。見圖3、4。

圖3 Treg谷值預測RFA術后腫瘤進展的受試者工作曲線

圖4 Treg達谷時間預測RFA術后腫瘤進展的受試者工作曲線

以上述2個最佳臨界值為分類標準作Kaplan-Meier曲線表明，肝癌RFA術后Treg谷值≤4.82%的腫瘤無進展生存率優于Treg谷值＞4.82%的患者，中位疾病無進展生產期（PFS）分別為10.1個月 （95%CI：8.926～11.217）、6.9 個月 （95%CI：5.227～8.648）；Treg達谷時間 ≥ 5.5個月的患者預后優于Treg達谷時間 ＜5.5個月患者；中位PFS分別為 10.9 個月 （95%CI：9.891～11.842）、5.9 個月（95%CI：4.602～7.265）。 Log-rank檢驗分別為 χ2=5.207，P=0.023；χ2=22.079，P ＜ 0.01。 見圖 5、6。

圖5 不同水平的Treg谷值與腫瘤無進展生存的關系

圖6 不同水平的Treg達谷時間與腫瘤無進展生存的關系

3 討論

Treg細胞是一群能抑制免疫功能的負性調控細胞，已成為腫瘤免疫學的熱點問題之一。其中研究進展最快、對其特性了解最多的是CD4+CD25+Treg細胞。存在于腫瘤微環境中的腫瘤抗原和細胞因子對于Treg細胞的募集、擴增和Treg細胞的誘導有重要的作用［5］。CD25是IL-2受體的α鏈，是Treg細胞重要的表面標志之一。CD4+CD25+T細胞在正常人或小鼠外周血中占CD4+T細胞5%～10%，活化的CD4+CD25+T細胞可能通過抑制CD4+、CD8+T細胞的IL-2基因轉錄及表達從而抑制T細胞的活化和增殖［6］。研究發現轉錄因子Foxp3基因為CD4+CD25+Treg細胞生成和免疫調節功能發揮的關鍵基因，可作為Treg細胞的特異性標記［7］。近年研究發現，腫瘤周圍有大量CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞浸潤，通過抑制或殺傷效應性CD8+或CD4+T細胞而抑制機體的抗腫瘤免疫，去除荷瘤鼠體內的Treg細胞可使抗腫瘤作用增強［8］，進一步研究認為Treg細胞可通過增加分泌IL-10和轉化生長因子β、減少分泌IL-2等干擾抗腫瘤的免疫反應［9］，也可通過RANKL-RANK信號途徑促進腫瘤轉移［10］。對腫瘤臨床特征分析，發現高Treg細胞水平與肝硬化背景和更高的TNM分期相關［11］。采用COX模型分析發現Foxp3+Treg細胞水平可以預測肝癌的復發及生存期［12］。本研究也發現RFA術后隨訪12月，腫瘤緩解組術前Treg細胞水平顯著低于腫瘤進展組，表明RFA術前Treg細胞水平與預后相關。

肝腫瘤RFA治療后短時間內在壞死區周圍間質帶熱休克蛋白增加，激活機體免疫反應。數周或數月后可檢測到腫瘤抗原特異性CD4、CD8 T細胞升高［13］。對乳腺癌大鼠模型，RFA治療后在腫瘤邊緣區可檢測到高水平NK細胞浸潤，增加熱休克蛋白表達和激活caspase-3酶，同時循環Treg細胞水平顯著下降［14］。對大鼠肝癌模型應用手術切除及RFA治療，分析Treg細胞水平變化，發現手術切除后Treg細胞水平較RFA治療后明顯升高，并且Treg細胞水平與腫瘤大小呈正相關，認為RFA在術后恢復階段可穩定Treg細胞水平，而手術切除能激活免疫抑制反應促進腫瘤生長［15］。肺癌RFA治療后可以下調Treg細胞水平，與RFA的遠期療效相關［16］。

本課題組所采用的冷循環RFA為新一代RFA治療儀。冷循環電極采用冷凍灌注液從內部冷卻電極，使臨近電極針的組織發熱減輕，防止其炭化，從而增加總的能量，增加熱凝固效應。本研究通過觀察RFA治療后HCC患者調節性T細胞表達的動態變化，首次探討調節性T細胞變化對HCC患者預后的影響。發現RFA可降低HCC患者Treg細胞水平。ROC表明Treg谷值以4.82為最佳臨界值時，Treg達谷時間以5.5個月為最佳臨界值。采用Kaplan-Meier曲線分析表明，肝癌RFA術后Treg谷值≤4.82的腫瘤無進展生存率優于Treg谷值＞4.82的患者；Treg達谷時間≥5.5個月的患者預后優于Treg達谷時間＜5.5個月患者。

綜上所述，冷循環RFA治療可以下調HCC患者Treg細胞水平，進一步對其動態變化分析發現Treg谷值及Treg達谷時間在一定程度上反映RFA治療HCC患者的預后。冷循環射頻消融治療所誘導的免疫機制可能為影響肝癌患者預后的重要因素之一。

［1］ Forner A， Llovet JM， Bruix J.Hepatocellular carcinoma［J］.Lancet， 2012， 379： 1245-1255.

［2］ Shiina S， Tateishi R， Arano T， et al.Radiofrequency ablation for hepatocellular carcinoma：10-year outcome and prognostic factors［J］.Am J Gastroenterol， 2012， 107： 569-577； quiz 578.

［3］ Haen SP， Pereira PL， Salih HR， et al.More than just tumor destruction：immunomodulation by thermal ablation of Cancer［J］.Clin Dev Immunol， 2011： 160250.

［4］ 陳敏山.肝癌局部消融治療規范的專家共識 ［J］.實用肝臟病雜志，2011，19：243-245.

［5］ Ondondo B，Jones E，Godkin A，et al.Home sweet home：the tumor microenvironment as a haven for regulatory T cells［J］.Front Immunol， 2013， 4： 197.

［6］ Baecher-Allan C，Brown JA，Freeman GJ，et al.CD4+CD25high regulatory cells in human peripheral blood ［J］.J Immunol，2001，167：1245-1253.

［7］ Yagi H，Nomura T，Nakamura K，et al.Crucial role of FOXP3 in the development and function of human CD25+CD4+regulatory T cells［J］.Int Immunol， 2004， 16： 1643-1656.

［8］ Hindley JP， Jones E， Smart K， et al.T-cell trafficking facilitated by high endothelial venules is required for tumor control after regulatory T-cell depletion ［J］.Cancer Res， 2012，72：5473-5482.

［9］ Wu CP，Qing X，Wu CY，et al.Immunophenotype and increased presence of CD4（+）CD25（+） regulatory T cells in patients with acute lymphoblastic leukemia ［J］.Oncol Lett， 2012， 3： 421-424.

［10］ Tan W， Zhang W， Strasner A， et al.Tumour-infiltrating regulatory T cells stimulate mammary Cancer metastasis through RANKL-RANK signalling［J］.Nature， 2011， 470： 548-553.

［11］ Zhou J，Ding T，Pan W，et al.Increased intratumoral regulatory T cells are related to intratumoral macrophages and poor prognosis in hepatocellular carcinoma patients［J］.Int J Cancer，2009，125：1640-1648.

［12］ Lin SZ， Chen KJ， Xu ZY， et al.Prediction of recurrence and survival in hepatocellular carcinoma based on two Cox models mainly determined by FoxP3+regulatory T cells［J］.Cancer Prev Res （Phila）， 2013， 6： 594-602.

［13］ Widenmeyer M， Shebzukhov Y， Haen SP， et al.Analysis of tumor antigen-specific T cells and antibodies in Cancer patients treated with radiofrequency ablation ［J］.Int J Cancer， 2011，128：2653-2662.

［14］ Todorova VK， Klimberg VS， Hennings L， et al.Immunomodulatory effects of radiofrequency ablation in a breast Cancer model［J］.Immunol Invest， 2010， 39： 74-92.

［15］ Gao HJ， Zhang YJ， Liang HH， et al.Radiofrequency ablation does not induce the significant increase of CD4 （+） CD25 （+）Foxp3 （+）regulatory T cells compared with surgical resection in Hepal-6 tumor model ［J］.Arch Immunol Ther Exp （Warsz），2013，61：333-340.

［16］ Fietta AM， Morosini M， Passadore I， et al.Systemic inflammatory response and downmodulation of peripheral CD25+Foxp3+T-regulatory cells in patients undergoing radiofrequency thermal ablation for lung Cancer ［J］.Hum Immunol， 2009， 70：477-486.