含碘的乳過氧化物酶-過氧化氫-硫氰化物系統對變異鏈球菌致齲性的影響

劉學軍 劉瑤 梁晶 史璐 楚金普 李蓓蕾

鄭州大學口腔醫學院牙體牙髓病學教研室，鄭州 450052

唾液過氧化物酶系統（peroxidase system，PS）是唾液中的抗菌成分，主要包括3個組分：過氧化物酶（peroxidase，PO）、過氧化氫（peroxide，H2O2）和底物，底物包括含硫氰酸根離子（thiocyanate，SCN-）、碘離子（iodine，I-）等的化合物。只有當3個組分都存在時，PS才具有活性。PO可催化H2O2將含I-、SCN-的底物分別氧化為次碘鹽OI-、次硫氰酸鹽OSCN-[1]。OI-和OSCN-均為強氧化劑，能氧化對巰基敏感的酶，干擾微生物代謝，有效抑制多種細菌和真菌的生長[2]?？谇籔O主要存在于口腔唾液和齦溝液中，主要由唾液過氧化物酶（salivary peroxidase，SPO）和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）組成。SPO和MPO不易獲取，至今尚未得到純品。乳過氧化物酶（lactoperoxidase，LPO）存在于乳汁中，因其來源廣泛，容易獲取，結構和功能與SPO非常相似，所以實驗中多以LPO作為SPO的替代物。乳過氧化物酶系統（lactoperoxidase system，LPS）已應用于多種口腔保健品中[3]，這些口腔保健品中多以SCN-作為底物，I-的應用還較少。雖然I-氧化產物的抑菌效果遠遠超過SCN-氧化產物，但是唾液中固有的生理濃度的SCN-存在時會顯著抑制LPO-I-的抗菌效應[4]，所以LPO-I-系統的抗菌效應未能得到有效的開發和利用。

本研究擬通過增加I-的量來抵消生理濃度SCN-對I-的抑制作用，從而探索有效發揮I-抗變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）作用的途徑，并進一步研究含不同濃度I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系統對S. mutans的黏附、葡萄糖基轉移酶（glucosyltransferase，GTF）活性和水不溶性細胞外多糖生成等多個致齲毒力因子的影響，為I-在防齲口腔保健中的應用和推廣提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株與主要試劑

S. mutans ATCC 25175（血清型C，由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供）；腦心浸液補充（brain heart infusion-supplemented，BHI-S）瓊脂培養基、腦心浸液（brain heart infusion，BHI）液體培養基（青島高科園海博生物技術有限公司）；硫氰酸鉀、碘化鉀、30%H2O2（天津市福晨化學試劑廠）；LPO（Sigma公司，美國）；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 溶液Ⅰ的配制

溶液Ⅰ（當實驗中底物為I-和SCN-時，pH值為6.5）配方[4]如下：9 mmol·L-1Na2HPO40.651 g，24 mmol·L-1KH2PO40.656 g，1.5 mmol·L-1MgSO40.036 g，67 mmol·L-1Na2SO41.922 g，加蒸餾水溶解稀釋至200 mL，調節pH值為6.5，備用。

1.3 細菌的復蘇及培養

將S. mutans凍干粉菌株接種于BHI-S瓊脂培養基上于37 ℃及80%N2、10%H2、10%CO2環境下培養48 h，鑒定為純培養物后，接種于BHI液體培養基培養24 h，收集細菌，并用溶液Ⅰ調整，調整溶液Ⅰ的菌懸液密度，使其OD600=0.9，備用。

1.4 試劑的配置及分組

實驗中分別配制LPO（5 μg·mL-1），H2O2（終濃度100 μmol·L-1），SCN-（終濃度1 mmol·L-1）和I-（終濃度分別為0、10、100、1 000、10 000 μmol·L-1）。將S. mutans分為6組，分別加入不同的試劑：5個實驗組分別加入不同濃度I-，并設1個對照組；每組又分為A、B管，A管加H2O2、SCN-和I-，不加LPO；B管加H2O2、SCN-、I-和LPO。

1.5 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統對S. mutans生長的影響

將S. mutans分為6組，每組加入0.1 mL菌懸液，2.5 mL SCN-，B管加2.5 mL LPO（A管以2.5 mL溶液Ⅰ代替），2.5 mL I-，2.5 mL H2O2，對照組加10.0 mL溶液Ⅰ。30 min后加10 μL DTT（終濃度為1 mmol·L-1）終止反應，進行10倍系列稀釋得到3個濃度梯度，將稀釋液體涂布到BHI瓊脂培養皿上，厭氧培養24 h，計數菌落形成單位（clonal formation unit，CFU），換算成lgCFU·mL-1。

1.6 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統對S. mutans黏附作用的影響

取菌液0.3 mL，與含2%蔗糖的BHI液體培養基按體積比1∶10的比例接種S. mutans，各組加入 SCN-0.1 mL，I-0.1 mL，H2O20.1 mL，B管加入LPO 0.1 mL（A管以0.1 mL溶液I代替LPO），對照組加0.4 mL溶液Ⅰ，30 min后加DTT終止反應，試管與水平面呈30°，厭氧培養48 h后收集試管壁上黏附的細菌，置于分光光度計下測量OD600值，計算細菌的黏附抑制率。黏附抑制率=（對照組OD600-實驗組OD600）/對照組OD600×100%。

1.7 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統對S. mutans生成水不溶性細胞外多糖的影響

試劑加入量同步驟1.6。取菌液0.3 mL，與含2%蔗糖的BHI液體培養基按體積比1∶10的比例接種S.mutans，加入各試劑反應30 min后加DTT終止反應，厭氧培養24 h后離心收集細菌，蒸餾水洗滌，再用0.5 mol·L-1NaOH洗滌，收集上清液，用蒽酮法檢測水不溶性細胞外多糖的質量濃度（μg·mL-1）。

1.8 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統對S. mutans GTF活性的影響

試劑加入量同步驟1.6。取菌液0.3 mL，與含2%蔗糖的BHI液體培養基按體積比1∶10的比例接種S.mutans，加入各試劑反應30 min后加DTT終止反應，厭氧培養24 h后離心收集上清液，用鹽析法提取GTF粗酶，蒽酮法測定酶-底物反應液中的還原糖量，計算GTF活性。

1.9 統計學分析

實驗數據由SPSS 17.0軟件進行統計學處理，采用t檢驗比較相同I-濃度組A、B管間S.mutans數量是否有差異，各組總體均數的比較采用單因素方差分析，各組間均數的兩兩比較采用LSD檢驗，兩變量之間的相關分析采用Pearson檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統對S. mutans生長的影響

各組的lgCFU·mL-1見圖1。A管不加LPO，各實驗組與對照組之間lgCFU·mL-1無明顯差異。B管加入LPO，反應30 min后，各實驗組lgCFU·mL-1較A管明顯變小，差異有統計學意義（P＜0.05）；隨著I-濃度的升高，lgCFU·mL-1逐漸減小，當I-≥100 μmol·L-1時，實驗組lgCFU·mL-1明顯地低于對照組，其差異有統計學意義（P＜0.05）；當I-濃度分別為1 000、10 000 μmol·L-1時，實驗組間兩兩比較均有明顯差異（P＜0.05）。

圖1 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統對S. mutans生長的影響Fig 1 The effect of LPO-H2O2-SCN- system with I- on the growth of S. mutans

2.2 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統對S. mutans黏附作用的影響

A管不加LPO，各實驗組和對照組間OD600值無明顯差異；B管加入LPO反應30 min，各實驗組OD600值較A管明顯變?。▓D2）。B管各組OD600測量值和黏附抑制率見表1，可見隨著I-濃度的升高，OD600值減小，LPO-H2O2-SCN-抗菌系統對S.mutans的黏附抑制率升高。除10、100 μmol·L-1濃度組外，其他I-濃度組間的差異有統計學意義（P＜0.05）；且各實驗組與對照組間的差異均有統計學意義（P＜0.01）。當I-≥100 μmol·L-1時，對S.mutans的黏附抑制率達到50%以上。

圖2 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統對S. mutans黏附作用的影響Fig 2 The effect of LPO-H2O2-SCN- system with I- on the adhesion of S. mutans

表1 B管LPO-H2O2-SCN-系統對S. mutans黏附作用的影響Tab 1 The effect of LPO-H2O2-SCN- system on the adhesion of S. mutans in tube B

2.3 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統對S. mutans生成水不溶性細胞外多糖的影響

各組S.mutans生成水不溶性細胞外多糖的質量濃度見圖3。A管中，各實驗組和對照組間水不溶性細胞外多糖的質量濃度無明顯差異（P＞0.05）。B管加入LPO反應30 min后，水不溶性細胞外多糖的質量濃度較A管明顯降低，其差異有統計學意義（P＜0.05）；隨著I-濃度的升高，水不溶性細胞外多糖的質量濃度隨之減少，當I-≥100 μmol·L-1時，水不溶性細胞外多糖生成量明顯減少，與對照組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統對S. mutans GTF活性的影響

各組S.mutans的GTF活性見圖4。A管中，各實驗組和對照組間S.mutansGTF活性的差異無統計學意義（P＞0.05）。B管加入LPO反應30 min后，GTF活性較A管明顯變小，其差異有統計學意義（P＜0.05）；且隨著I-濃度的升高，GTF活性降低，除0和10 μmol·L-1外，其余各組GTF活性的總體均數間的差異均有統計學意義（P＜0.05）；各實驗組與對照組均數之間的差異也有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 含I-的LPO-H2O2-SCN-系統對S. mutans生成水不溶性細胞外多糖的影響Fig 3 The effect of LPO-H2O2-SCN- system with I- on the synthesis of insoluble exopolysaccharides of S. mutans

2.5 GTF酶活性與水不溶性細胞外多糖含量的Pearson相關分析

以GTF酶活性為自變量，水不溶性細胞外多糖的質量濃度為因變量，經Pearson相關性分析，二者之間有明顯的正相關關系（r=0.806，P=0.000）。

3 討論

I-為底物時，LPO-H2O2-I-抗菌系統的有效殺菌成分主要為碘及其氧化物、單線態氧等物質[5]。碘和碘氧化物可以與蛋白質氨基酸側鏈基團結合導致蛋白質變性沉淀；也能氧化核酸，破壞DNA和rRNA等[6]；另外，碘還可氧化攻擊還原型輔酶Ⅱ進而影響細菌代謝[7]。單線態氧是高活性氧化基團，可以氧化損傷微生物細胞膜，氧化攻擊蛋白質和酶，也能與DNA分子中的鳥嘌呤反應，影響酶的合成，干擾細菌代謝[8]。由此可見，LPO-H2O2-I-抗菌系統有多種機制可以共同作用導致微生物生長抑制或死亡。

本實驗中，各組均設置了A、B兩個管，A管不加LPO，底物（I-、SCN-）不能被H2O2氧化為OI-、OSCN-等物質，含不同濃度I-的LPO-H2O2-SCN-系統的抗菌效應無法發揮，僅在I-（10、100、1 000、10 000 μmol·L-1）和微量H2O2（100 μmol·L-1）作用下，S. mutans的生長、黏附、產水不溶性細胞外多糖和GTF活性的抑制作用并不明顯。B管加入LPO反應30 min，底物（I-、SCN-）被氧化，含不同濃度I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系統可以顯著抑制S. mutans生長、黏附、產水不溶性細胞外多糖和GTF活性。這說明，雖然I-有一定的抑菌作用，但是LPS抗菌效應的發揮依賴于氧化性物質（碘及其氧化物、單線態氧等）的生成，同時也說明只有當LPO、H2O2和底物（SCN-、I-等）這3個組分同時存在時，LPS才能顯示出強大的抗菌活性[9]。

B管在實驗時間（30 min）內，隨著I-濃度的升高，抗菌系統抑制S. mutans生長的能力增強，當I-濃度達到1 000 μmol·L-1時，含雙底物的LPS對S. mutans的抑制作用明顯高于只含SCN-的實驗組，說明隨著I-濃度增加，生理濃度的SCN-對LPO-H2O2-I-的競爭性抑制作用可以被抵消，且當I-濃度足夠大時可發揮顯著的抗菌作用。

黏附實驗中B管結果顯示，隨著I-濃度的升高，黏附S. mutans的OD600值減小，含不同濃度I-的LPOH2O2-SCN-抗菌系統對S. mutans的黏附抑制率升高，在I-濃度增至100 μmol·L-1時，黏附抑制率超過50%。雖然LPO-H2O2-SCN-抗菌系統和含不同濃度I-的LPOH2O2-SCN-抗菌系統都可有效抑制S. mutans黏附，但隨著I-的加入，抗菌系統抑制S. mutans黏附能力顯著增強。含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系統的自由基（單線態氧等）和底物的活性氧化態（OSCN-/HOSCN和OI-/HOI）可能通過氧化氨基酸殘基、使S. mutans黏附素、GTF和葡聚糖結合蛋白（glucan-binding protein，GBP）失活而抑制其黏附能力。

于曉霞[10]采用閃爍計數法測定酶活性，發現LPO可抑制GTFD的活性。Korpela等[11]的研究結果表明，LPO-H2O2-SCN-抗菌系統可抑制吸附于羥磷灰石上的GTFC和GTFD活性。本實驗結果也表明，含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系統能夠有效抑制GTF的活性和水不溶性細胞外多糖的生成，且抑制能力隨著I-濃度的升高而增強。經Pearson相關檢驗，GTF活性與水不溶性細胞外多糖含量之間有明顯的正相關關系（r=0.806，P=0.000），含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系統抑制了GTF酶的活性，則水不溶性細胞外多糖含量也隨之減少。由此結果可見，除了強大的抑菌作用，含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系統防治齲病的另一主要機制可能是抑制GTF活性，進一步抑制了S. mutans的黏附能力和降低了水不溶性細胞外多糖的生成。

綜上所述，只有當3個組分（LPO、H2O2和底物）都存在時，LPS才能顯示出強大的抗菌活性；增加I-的濃度，可以抵消生理濃度的SCN-的抑制作用，使含I-的LPO-H2O2-SCN-抗菌系統發揮顯著的抑制S. mutans生長、黏附、生成水不溶性細胞外多糖和GTF活性的作用；因此LPO-I--H2O2系統在預防齲病方面有著比較優越的應用前景，有望成為一種有效的防齲藥物。

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