輻射對體外培養MC3T3-E1成骨前體細胞增殖和分化的影響

李玉梅 趙銥民 查年保 舒震 張松

1.襄陽市中心醫院口腔科，襄陽 441021；2.第四軍醫大學口腔醫院修復科；

3.第四軍醫大學藥學系生物技術中心，西安 710032；4.第四軍醫大學唐都醫院藥劑科，西安 710038

高劑量的放射治療會對正常的骨組織產生不良作用，如骨質疏松、放射性骨壞死、顱面部骨生長遲緩等。1983年，Marx[1]提出了被廣泛接受的骨壞死病理機制：即射線引起動脈內膜炎，接著發生組織缺氧、細胞數減少以及血管減少，最終出現慢性不愈合的傷口。其后學者們的研究更加關注于骨細胞，并認為骨細胞的改變要先于血管，而骨重建的抑制是發生骨壞死的關鍵所在[2]。本文擬從MC3T3-E1成骨前體細胞入手，探討60Co γ射線對成骨細胞增殖和分化的影響，為輻射骨損傷的防治提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器設備

α-MEM培養基（HyClone公司，美國），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），β-磷酸甘油、抗壞血酸（西安沃爾森生物技術有限公司），3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻藍 [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte-trazolium bromide，MTT]（西安科昊生物工程有限責任公司）；黏膠纖維紅（Sigma公司，美國），茜素紅（西安舟鼎國生物技術有限公司）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）相關試劑（TaKaRa公司，日本）；酶標儀（BIO-TEK公司，美國）；60Co源（第四軍醫大學鈷源室）；7500型qPCR儀（ABI公司，美國），基因擴增儀（東勝創新生物科技有限公司）。

1.2 細胞培養及成骨誘導

采用MC3T3-E1成骨前體細胞系亞克隆14（上海中科院細胞庫）進行實驗。使用含10%新生牛血清、100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的α-MEM培養基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，常規換液與傳代。用成骨誘導培養基誘導細胞成骨。成骨誘導培養基：在上述培養基里添加5 mmol·L-1的β-磷酸甘油和50 μg·mL-1抗壞血酸。

1.3 細胞輻射

MC3T3-E1細胞接種24 h后進行60Co γ射線照射。單次照射劑量分別為4、8 Gy，換液后繼續培養觀察。對照組帶入準備室，但不接受照射。

1.4 細胞增殖實驗

細胞以每孔1.5×103個的密度接種于96孔板，培養24 h后分別接受4、8 Gy射線照射。照射后1、3、5、7 d終止培養，PBS漂洗1次，每孔加入20 μL MTT（5 g·L-1）和200 μL無血清α-MEM培養基。37 ℃孵育4 h后吸棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶解生成的結晶物，室溫下振蕩20 min，然后置于分光光度儀上于490 nm處測量其光密度（optical density，OD）值。

1.5 細胞膠原分泌的測定

使用黏膠纖維紅染色法測定膠原分泌[3]。細胞以每孔7.5×104個的密度接種于6孔板，培養24 h后接受4、8 Gy射線照射。細胞接近融合后更換為成骨誘導培養基。輻射后第12天終止細胞培養，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3遍。0.1%黏膠纖維紅（溶于飽和苦味酸）染色18 h，鹽酸漂洗，細胞照相。定量分析時，加入氫氧化鈉溶解染色，570 nm處測量OD值。

1.6 成骨相關基因mRNA表達的測定

采用qPCR法檢測4種成骨相關基因mRNA的表達，分別為Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、轉錄因子Osterix（OSX）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和骨鈣素（osteocalcin，OCN）。細胞以每孔7.5×104個的密度接種于6孔培養板，培養24 h后分別接受4、8 Gy射線照射。細胞接近融合后更換為成骨誘導培養基。輻射后第16天終止細胞培養，PBS漂洗后用適量Trizol裂解細胞，按試劑盒描述的步驟提取總RNA并定量。取1.0 μg總RNA，按照Prime Script RT reagent Kit說明進行逆轉錄，條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。配制qPCR反應液，所使用的引物見表1，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參，置于7500型qPCR儀內進行反應。采用2-ΔΔCt法對數據進行相對定量分析，0 Gy組數據作為校正樣本。

表1 qPCR所使用的引物Tab 1 Primers used for qPCR

1.7 細胞基質礦化測定

使用茜素紅染色測定細胞基質礦化情況。細胞以每孔5×104個的密度接種于6孔板，培養24 h后接受4、8 Gy射線照射。細胞接近融合后更換為成骨誘導培養基。輻射后第28天終止細胞培養，PBS漂洗2次，75%乙醇固定1 h。40 mmol·L-1茜素紅染液（pH=4.2）室溫染色20 min，PBS漂洗5次后10%氯化十六烷基吡啶溶解染色，置于分光光度儀上于570 nm處測OD值。

1.8 統計學分析

使用SPSS 16.0統計分析軟件，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較各組均數之間有無差異，Tukey顯著差異法進行均數之間的兩兩比較，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 細胞增殖實驗

細胞增殖實驗結果見表2。與未輻射組相比，從輻射后第3天開始，4、8 Gy的輻射劑量均導致MC3T3-E1細胞的增殖明顯降低（P＜0.05），并且這種降低呈現劑量依賴性。

2.2 細胞膠原分泌

經不同劑量的輻射后，MC3T3-E1細胞膠原分泌的染色情況見圖1：隨輻射劑量的增加，染色強度逐漸降低。對照組（0 Gy）、4 Gy和8 Gy組膠原定量分析的OD值分別為1.368±0.208、1.059±0.169和0.856±0.078，3組間的差異有統計學意義（F=7.738，P=0.022），8 Gy組明顯低于對照組。

表2 經不同劑量輻射后細胞MTT實驗的OD值Tab 2 The OD value of cells in MTT assay under different radiation doses

圖1 經不同劑量輻射后細胞的膠原分泌 黏膠纖維紅染色 × 6.3Fig 1 Collagen secretion by cells under different radiation doses sirius red staining × 6.3

2.3 成骨相關基因mRNA的表達

4種成骨相關基因的表達見表3：4 Gy以上射線可以明顯抑制MC3T3-E1細胞OSX和OCN基因的表達（P＜0.05），但對RUNX2基因無明顯影響（P＞0.05）；8 Gy射線可輕微下調細胞OPN基因的表達，但與對照組相比差異并無統計學意義（P＞0.05）。

表3 經不同劑量輻射后細胞成骨相關基因的表達Tab 3 Expression of osteogenesis-related genes of cells under different radiation doses

2.4 細胞基質礦化

對照組（0 Gy）、4 Gy和8 Gy組細胞基質礦化定量分析的OD值分別為2.155±0.257、1.728±0.265、1.485±0.042，3組差異有統計學意義（F=7.497，P=0.023），隨著射線劑量增大細胞基質礦化降低，8 Gy照射組與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

MC3T3-E1成骨前體細胞系來源于新生小鼠顱頂骨，在體外可以分化為骨細胞，是較常用的研究射線對成骨細胞影響的細胞系之一[4]。檢測射線對細胞增殖影響的主要方法有克隆形成實驗、MTT法、細胞計數以及DNA含量測定等。MTT實驗是測試射線對細胞活性影響可靠、方便的方法之一。通過MTT實驗，本研究發現，從輻射后第3天開始，4 Gy以上的輻射劑量顯著降低了MC3T3-E1細胞的增殖，與以往文獻[4-6]報道一致。

骨的有機成分主要是Ⅰ型膠原，而黏膠纖維紅染色能特異性檢測Ⅰ型和Ⅲ型膠原，并能夠在原位確定產生膠原的細胞[3]。本研究顯示，8 Gy射線顯著抑制了MC3T3-E1細胞膠原分泌，與Gal等[6]的研究結果類似。本研究采用茜素紅染色及定量分析對MC3T3-E1細胞基質礦化能力進行檢測，結果表明，8 Gy射線導致細胞礦化能力顯著降低。Gevorgyan等[7]研究證明，15 Gy射線可引起兔眶顴復合體骨膜來源成骨細胞礦化能力明顯下降。

本研究進一步探討了射線對于MC3T3-E1細胞成骨相關基因表達的影響。RUNX2是與果蠅蛋白Runt同源的成骨相關轉錄因子，可與成骨特異順式作用元件結合，調節OCN、Ⅰ型膠原α1鏈（collagen type Ⅰα1-chain，Col-Ⅰα1）和OPN基因的表達。本研究表明，在輻射后第16天，8 Gy射線并沒有引起RUNX2基因mRNA水平的改變；Sch?nmeyr等[8]的研究也得出相似的結論。OSX是另一個重要的成骨相關轉錄因子，位于RUNX2的下游。在多能間充質干細胞向前成骨細胞分化過程中，RUNX2起了重要作用，而在其后的調控前成骨細胞向成熟成骨細胞分化的過程中，RUNX2的表達下調，OSX則成為主要的作用基因[9]。本研究發現，4 Gy以上射線顯著抑制了細胞OSX基因的表達，由此推測，射線有可能在成骨過程的中晚期通過下調OSX基因的表達來抑制細胞的分化能力。OPN是一種酸性糖蛋白，在成骨細胞增殖期有低表達，隨后下降；在細胞礦化起始期（第16～20天）第2次表達并達到峰值。OCN在礦化結節形成時才開始表達，是成骨細胞成熟的標志[10]。本研究顯示，射線可抑制OCN基因的表達，隨著射線劑量的增加，抑制作用增強，與其他文獻[5,11]報道一致。對于OPN基因，射線并無明顯下調作用。Matsumura等[11]發現，MC3T3-E1細胞接受10 Gy射線照射后，輻射后第16天OPN的表達與未照射組相比無明顯改變。

本研究從細胞和分子層面揭示了輻射骨損傷發生的可能機制，證實60Co γ射線可以降低MC3T3-El成骨前體細胞的增殖、膠原分泌及基質礦化能力，并可下調其成骨相關基因的表達。

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