乙型肝炎病毒X基因在涎腺腺樣囊性癌中表達的實驗研究

謝玲 王衛(wèi)紅 許彪 劉嶼

1.新津縣人民醫(yī)院口腔科，成都 611403；2.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，昆明 650031

近年來，隨著分子生物學(xué)研究的進展，越來越多的研究表明，全球8%～17%的腫瘤與病毒或細(xì)菌等慢性感染有關(guān)，如乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）與肝癌[1]。然而HBV可感染身體其他部位[2-3]，在這些器官、組織和細(xì)胞中均可檢測到HBV DNA。這說明HBV嗜肝性不十分嚴(yán)格，有一定的泛嗜性。研究[4-5]表明唾液中也可檢測到HBV，涎腺組織也易感染HBV[6]。乙型肝炎病毒X基因（hepatitis B-virus X gene，HBX）對肝癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，涎腺組織也易感染HBV，推測HBX在涎腺腺樣囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）中可能存在表達，且對ACC的發(fā)生、發(fā)展可能起著重要作用。本研究利用臨床手術(shù)中保留的ACC新鮮組織標(biāo)本，探討HBX在ACC中的表達及其意義。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本和方法

選取2008年6月—2012年10月就診于昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科的涎腺腫瘤患者為研究對象。經(jīng)患者同意后，行HBV血清學(xué)檢查。將臨床手術(shù)中切取的部分新鮮涎腺腫瘤標(biāo)本放入-196 ℃液氮罐中備用，根據(jù)血清學(xué)檢查和術(shù)后病理結(jié)果將患者分為ACC組和對照組（涎腺腺淋巴瘤組），每組14例。每組中男6例，女8例，年齡26～53歲，平均42.5歲。無論血清學(xué)結(jié)果中HBeAg是陽性或陰性，以HBeAb陽性為HBV攜帶者或曾感染者[7-8]。

1.2 主要試劑

乙型肝炎病毒X抗體（Abcam公司，英國），通用型免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），總RNA提取試劑和Quant cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

取凍存的部分涎腺腫瘤組織行石蠟包埋，石蠟塊作4 μm切片供免疫組織化學(xué)染色。SP免疫組織化學(xué)法檢測涎腺腫瘤標(biāo)本中HBX的表達，HBX抗體濃度配制為原濃度的1/200倍。以PBS代替一抗作為陰性對照。以腫瘤細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒且著色強度高于背景非特異性染色者判斷為陽性。在相同光源強度下，每張切片隨機選取10個視野，每個視野下選取5張圖片（×400），保存圖像格式為TIFF。應(yīng)用Image-Pro plus 6.0軟件對圖像進行分析，錄制Macro中測量參數(shù)包括光密度矯正、平均光密度、面積最小值。取得每個視野的平均光密度值。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測HBX mRNA的表達

取凍存的部分涎腺腫瘤組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增，β-actin為內(nèi)參，PCR反應(yīng)所用引物設(shè)計如下。HBX上游引物序列為5’-GGAAGACACAATGAAGAAT-3’，下游引物序列為5’-CACCACAGGAATATCAGT-3’，產(chǎn)物大小為169 bp；β-actin上游引物序列為5’-TGCGTGACATTAAGGAGAA-3’，下游引物序列為5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGT-3’，產(chǎn)物大小為172 bp。反應(yīng)條件為：95 ℃30 s，55 ℃ 45 s ，72 ℃ 30 s，共30循環(huán)，72 ℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，采用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)進行凝膠成像。應(yīng)用Gel-Pro analyzer 4.0軟件對PCR圖像進行分析，分析涎腺腫瘤標(biāo)本中HBX mRNA表達（光密度值）。分析前將圖片色彩進行反轉(zhuǎn)，重復(fù)3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。對于兩組中HBX的表達率，非參數(shù)數(shù)據(jù)加權(quán)后，采用Crosstabs卡方分析；對于兩組中HBX的表達強度，其獨立樣本定量資料進行t檢驗統(tǒng)計分析，以P＜0.05為兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

每組中抗HBeAb陽性和陰性者各7例（表1）。28例涎腺腫瘤組織中，14例HBeAb陽性涎腺腫瘤中HBX陽性表達10例，另14例HBeAb陰性涎腺腫瘤中HBX陽性表達1例，HBeAb陽性涎腺腫瘤中HBX陽性率明顯高于HBeAb陰性涎腺腫瘤（χ2=12.13，P＜0.01）。而ACC組和對照組中HBX陽性率無明顯差異（χ2=1.348，P=0.246）（表1）。HBX大多數(shù)表達于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，小部分表達于胞核內(nèi)。HBX免疫組織化學(xué)染色為胞漿棕黃染色（圖1），HBX在ACC中表達強度強于涎腺腺淋巴瘤，其平均光密度值分別為0.238±0.022、0.157±0.021，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.909，P＜0.01）。RT-PCR結(jié)果顯示HBX mRNA水平在ACC中高于涎腺腺淋巴瘤，其平均光密度值分別為0.171±0.046、0.075±0.006，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.437，P=0.029）。

表1 HBX在不同涎腺腫瘤組織中的表達Tab 1 The expression of HBX in different salivary tissues n=14

圖1 HBX在ACC和涎腺腺淋巴瘤中的表達 SP × 400Fig 1 Expression of HBX in ACC and Warthin tumor SP × 400

3 討論

HBX基因是HBV 4個開放讀碼框架（open reading frame，ORF）中最小的一個編碼。HBX主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，小部分位于細(xì)胞核內(nèi)。胞質(zhì)中的HBX參與調(diào)控多條影響細(xì)胞生存、分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。而胞核中的HBX具有反式激活作用，HBX蛋白的反式激活功能區(qū)內(nèi)有與p53結(jié)合的位點。HBX與p53結(jié)合后，胞質(zhì)中的p53進入細(xì)胞核受阻，使p53蛋白進入細(xì)胞核發(fā)揮正常負(fù)調(diào)節(jié)功能的過程受影響，導(dǎo)致p53基因的負(fù)調(diào)節(jié)功能失活，從而抑制p53誘導(dǎo)的凋亡，并與HBX一起反式激活，從而抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，二者長期相互作用導(dǎo)致細(xì)胞表型發(fā)生改變而最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[9-10]。

目前國內(nèi)外有關(guān)HBX基因的研究，多源于HBV相關(guān)性肝癌，而對于HBX基因在人體其他組織中的研究則較少[11]。以往研究[4-6]表明HBV嗜肝性不十分嚴(yán)格，有一定的泛嗜性，HBV對涎腺組織有較強的親和力，唾液中HBV可源于受染的唾液腺組織。由于唾液中存在著HBV，可能導(dǎo)致口腔上皮細(xì)胞損害及炎癥的發(fā)生，從而引起口腔腫瘤的發(fā)生。Takata等[12]認(rèn)為HBV感染與口腔良性腫瘤存在相關(guān)性。筆者研究表明HBeAb陽性涎腺腫瘤中HBX陽性率明顯高于HBeAb陰性涎腺腫瘤（P＜0.01），初步說明HBX在涎腺腫瘤的表達與HBV感染有關(guān)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示HBX在ACC和涎腺腺淋巴瘤中存在表達，平均光密度值分別為0.238±0.022、0.157±0.021，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。RT-PCR結(jié)果顯示：ACC組和對照組HBX mRNA平均光密度值分別為0.171±0.046、0.075±0.006，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.029），HBX在ACC中表達明顯高于對照組。說明HBX在ACC的發(fā)生、發(fā)展過程中可能扮演重要的角色。但本研究結(jié)果同時顯示，ACC組和對照組中HBX陽性率無明顯差異（P=0.246），可能是因為本組樣本量僅為28例，且沒有正常涎腺組織的對照，因此兩組間HBX陽性率無明顯差異并不能說明HBV感染與涎腺腫瘤無關(guān)。有1例HBeAb陰性ACC組織中HBX陽性表達，可能存在既往HBV感染，這需要進一步大量臨床資料研究證實。

初步研究表明HBX在ACC中存在表達，防治HBV感染，也許可阻斷癌基因HBX的表達，促進涎腺腫瘤細(xì)胞的凋亡。然而關(guān)于HBV感染與ACC或涎腺腫瘤的關(guān)系，還需進一步研究探討。

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