糞腸球菌體外根尖生物膜模型的建立及形態學研究

曹日丹 侯本祥

首都醫科大學附屬北京口腔醫院牙體牙髓科，北京 100050

糞腸球菌是根管治療失敗患牙最常分離出的細菌之一，被認為是導致根管治療后疾病的重要因素。研究[1-3]顯示，80%以上的慢性根尖周炎和持續性根尖周炎患牙的根尖牙骨質表面存在細菌生物膜。對根尖生物膜的形成及致病機制的研究[4-6]發現，糞腸球菌的生物膜結構可能使細菌具有更強的致病性，且很難被徹底清除，但具體機制仍有待深入研究。目前，建立糞腸球菌根管內生物膜模型的報道較多[5,7-11]，而對根尖生物膜模型的研究則非常罕見。本研究的目的是建立糞腸球菌根尖生物膜的體外模型，為糞腸球菌在根尖周炎中致病機制的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

離體人牙；糞腸球菌（糞腸球菌標準株ATCC 29212，北京口腔醫學研究所保藏管理中心），CDC培養基；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、刀豆球蛋白A異硫氰酸熒光素（ConA- fl uorescein isothiocyanate，ConA-FITC）熒光染液（Sigma公司，美國）；激光共聚焦培養皿（MatTek公司，美國），生化培養箱，掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、激光共聚焦掃描電子顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）（Leica公司，美國）；Photoshop CS5圖像分析軟件，Leica Q win圖像分析軟件。

1.2 離體牙的選擇及處理

選取因正畸減數需要而新鮮拔除的人單根管前磨牙24顆，要求根尖發育完全，根面無齲壞，無根裂或牙根外吸收。剔除根尖1/3過度彎曲的牙齒，清除樣本表面的牙周膜。

1.3 根尖生物膜模型的建立

1.3.1 根尖樣本的制作 將離體牙標本截去牙冠并拔髓，用ProTaper鎳鈦系統冠向下方法進行根管預備，預備至F2后用質量分數15%的乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）溶液5 mL作用3 min，5.25%次氯酸鈉溶液和生理鹽水交替超聲蕩洗5 min，熱牙膠根管充填，充填后拍攝X線片，若恰填則證明根管封閉可靠。截取離體牙7 mm長度的牙根，將其固定于樹脂基底座上，將金屬結扎絲末端也固定于樹脂基底座上，上方連接于玻璃瓶膠塞內，懸吊根尖樣本；將玻璃瓶膠塞中穿入注射針頭，使瓶內與厭氧罐中氣壓一致（圖1）；樣本紫外線消毒后置于無菌厭氧血瓊脂CDC液體培養基中37 ℃下厭氧培養2 d，若液體培養基澄清，說明樣本消毒徹底，4 ℃存放備用。

1.3.2 糞腸球菌菌液培養 糞腸球菌解凍復蘇，于生化培養箱中37 ℃下厭氧培養，然后分離純化，增菌并收集菌膜，置于無菌CDC液體培養基中，調整菌液密度為1×108CFU·mL-1，備用。細菌在CDC瓊脂板培養基上生長，形成菌落呈乳脂狀白色者為糞腸球菌菌落。

1.3.3 實驗分組 將24例離體牙根尖樣本隨機分為8組，即SEM觀察1、2、7 d組和對照組，CLSM觀察1、2、7 d組和對照組，每組3顆。實驗組浸泡于糞腸球菌ATCC 29212菌液中（37 ℃，厭氧環境），采用連續培養法，每2 d用新鮮的CDC液體更換菌液，建立根尖生物膜模型。分別于培養1、2、7 d取根尖樣本，置于無菌EP管中，1 mL PBS緩沖液沖洗3次；對照組樣本浸泡于無菌CDC液體培養基中（37 ℃，厭氧環境）7 d，處理步驟同實驗組。

圖1 糞腸球菌根尖生物膜模型建立裝置Fig 1 Device for Enterococcus faecalis bio fi lm formation

1.4 根尖生物膜形態學觀察

1.4.1 SEM觀察 將每組中的3例根尖組織樣本于2%戊二醛溶液中4 ℃固定1 h，然后于梯度乙醇中脫水，臨界點干燥，樣本表面噴金，置于SEM下觀察，每例樣本在SEM下隨機選取3個視野進行觀察，共9個視野。

1.4.2 CLSM觀察 將每組中的3例根尖組織樣本于2%戊二醛溶液中4 ℃固定1 h，-80 ℃冰凍，用50 μmol·mL-1ConA-FITC染色，室溫下染色5 min，然后PBS緩沖液洗滌，15 μmol·L-1PI室溫下染色5 min，標本在PBS緩沖液中洗滌，CLSM分別觀察生物膜逐層掃描圖像和疊加圖像。每例樣本在CLSM下隨機選取3個視野進行觀察，共9個視野。在CLSM下，細菌被PI染成紅色，細胞外基質被ConA-FITC染成綠色。

1.5 圖像分析

使用Photoshop CS5軟件計算放大3 000倍的SEM視野圖像中的生物膜覆蓋率（%），用Leica Q Win軟件計算CLSM樣本表面的生物膜覆蓋面積（μm2）。采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析，SEM觀察樣本表面生物膜覆蓋率的差異采用單因素方差分析，組間均數的比較采用t檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 SEM觀察不同時間生物膜的形成過程及覆蓋率

2.1.1 不同時間生物膜形成過程的觀察 通過SEM觀察，1 d組樣本表面的大部分區域未發現細菌附著，可見單層次散在分布的細菌，細菌之間無細胞外基質連接（圖2A）；2 d組樣本表面可見細菌單層散在分布，細菌之間出現細胞外基質連接，大部分區域仍未發現細菌附著（圖2B）；7 d組可見表面有大量細菌附著，細菌呈群落分布，形成多層次的空間結構，有大量細胞外基質包繞，并形成親水通道（圖2C）；對照組表面無細菌及細胞外基質附著（圖2D）。

圖2 不同時間糞腸球菌生物膜的形態 SEMFig 2 Enterococcus faecalis bio fi lm structure in different times SEM

2.1.2 不同時間生物膜覆蓋率的比較 SEM觀察1、2、7 d組的表面生物膜覆蓋率分別為3.16%±2.23%、5.80%±3.27%、17.23%±1.52%，平均9.04%±6.87%；對照組表面無細菌及細胞外基質附著。隨著培養時間的增加，樣本表面的生物膜覆蓋率也增加。經統計學分析，數據均滿足正態分布特征，且方差齊；經單因素方差分析，7 d組與1 d組之間、7 d組與2 d組之間的差異有統計學意義（P＜0.05），而1 d組與2 d組之間的差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 CLSM觀察不同時間生物膜的形態和結構

2.2.1 不同時間生物膜的形態和熒光面積 隨培養時間增加，PI染色的紅色熒光面積增加，ConA-FITC染色的綠色熒光面積從無到有，生物膜熒光總面積增加（表1和圖3）。1 d組樣本表面細菌散在分布，無細胞外基質（圖3A）；2 d組樣本表面細菌增多，無細胞外基質（圖3B）；7 d組表面有大量細菌，部分呈團狀分布，周圍有大量細胞外基質包繞（圖3C）；對照組表面無細菌及細胞外基質（圖3D）。

表1 不同時間根尖生物膜的熒光面積Tab 1 Fluorescent stained area of apical bio fi lm in different times μm2

圖3 不同時間糞腸球菌生物膜的形態 CLSM × 1 400Fig 3 Enterococcus faecalis bio fi lm structure in different times CLSM × 1 400

2.2.2 根尖生物膜逐層掃描觀察 CLSM可以通過對樣本表面進行水平逐層掃描，觀察生物膜不同層面的圖像，如生物膜內層和外層（圖4）；由于離體牙根尖樣本表面不平整，與激光共聚焦培養皿底存在一定的傾斜角度，在逐層掃描時所看到的層面同時包含了生物膜內層和外層。對比7 d組生物膜的內層和外層可以看出，生物膜的內層有大量細菌密集存在，并且被細胞外基質包繞；在生物膜的外層細菌分布相對松散，細胞外基質成分較內層少，在生物膜的表面有少量浮游細菌存在。

糞腸球菌生物膜剖面的CLSM掃描圖見圖5：掃描層面均與熒光投照方向垂直，而觀察圖像的方向與熒光投照方向平行；因為樣本表面與掃描層面存在一定的傾斜角度，掃描層面可以通過生物膜全層，因此從圖5可以清晰地看出生物膜從內層到外層的結構。

圖4 CLSM逐層掃描示意圖Fig 4 Diagrammatic section of CLSM scanning

圖5 糞腸球菌生物膜剖面的CLSM掃描圖 CLSM × 1 400Fig 5 CLSM scanning cross-section of Enterococcus faecalis bio fi lm CLSM × 1 400

3 討論

根管治療后疾病[12]是指根管治療后患牙的根尖周病變未愈合或出現新的病變，其臨床表現主要為患牙根管治療后疼痛持續存在或者根尖周病損經久不愈。

根尖生物膜的形成是根管治療后疾病的主要原因。患牙感染根管內的細菌可以穿過根尖孔而進入根尖周組織，在根尖周病損內的牙根表面上形成細菌生物膜結構。Sunde等[13]采用外科手術方法取出根管治療后疾病患牙的根尖進行SEM觀察，發現根尖外表面的細胞外基質包繞了大量球菌，從而認為根管治療失敗的原因是根外感染。

本實驗以糞腸球菌ATCC 29212為實驗菌株，是因為糞腸球菌是根管治療失敗的感染根管中最常分離出的細菌。本研究建立的糞腸球菌根尖生物膜的體外模型，具有一定的代表性，在糞腸球菌生物膜的形態學研究以及根管治療后疾病的致病機制研究中，具有重要的意義。

細菌生物膜是以細菌為主的微生物形成的生態群落，由細菌及細胞外基質組成，易于在惰性表面或壞死組織中生長，對抗生素及機體免疫反應具有抵抗性[4,14]。生物膜內細菌較其浮游狀態時對抗生素的耐藥性高100～1 000倍，這一特性是感染難以根除的重要原因之一[15]。

在本實驗中觀察到，隨著培養時間的延長，生物膜中細菌及細胞外基質均明顯增加，生物膜結構更加致密，體外培養7 d可以形成成熟的根尖生物膜結構。本實驗觀察到生物膜形成過程分為以下幾個階段：1）細菌在樣本表面可逆吸附；2）細菌不可逆附著，在樣本表面散在分布；3）細菌快速生長和繁殖，同時產生細胞外多糖及蛋白，生物膜開始形成；4）大量微生物附著，形成大的團簇樣結構，并不斷向外釋放小團的細菌，定植在樣本表面的其他部位。生物膜結構形成并且成熟后，感染范圍持續擴大，感染不易清除[14]。

現有研究中生物膜模型建立方法主要參照以下條件：1）樣本表面介質；2）樣本放置方法；3）培養條件。建立生物膜模型主要選擇96孔板和離體牙作為樣本表面。96孔板皿底表面的粗糙度一致，但牙本質小管、牙骨質等表面結構無法模擬。本實驗選用人離體牙根尖作為樣本，在牙骨質表面建立根尖生物膜模型，將離體牙根尖以豎直懸吊的方式置于菌懸液中，使得生物膜形成的樣本表面與重力方向平行，避免細菌由于重力作用沉降在樣本表面。本研究在生物膜形成的連續培養過程中，循環提供營養物質，使糞腸球菌生長維持在恒定的溫度和厭氧環境[16-18]。此模型能較穩定地控制生物膜形成的各項參數，具有良好的可重復性。

目前，SEM和CLSM是觀察生物膜的主要方法。SEM觀察法是目前應用最多的直觀觀察生物膜結構的方法[8,10]。SEM能夠清晰觀察到樣本表面的微細立體結構，一直是研究生物膜組成及結構的主要方法；但SEM多用于觀察表面結構，對于多層次的生物膜，則難以觀察到生物膜的全層結構，對于成熟并復雜的生物膜結構，也難以分辨其內細菌和基質的構成。CLSM是一種高精度顯微鏡系統，在熒光成像基礎上加裝激光掃描裝置，利用計算機進行圖像處理，使用紫外光或可見光激發熒光探針，得到微細結構的熒光圖像[19-20]。本研究使用兩種熒光染液PI和ConA-FITC分別染生物膜的細菌和基質，觀察生物膜的結構組成，為研究糞腸球菌生物膜在根尖周炎中的致病機制奠定了基礎。

[1]Noiri Y, Ehara A, Kawahara T, et al. Participation of bacterial bio fi lms in refractory and chronic periapical periodontitis[J].J Endod, 2002, 28(10):679-683.

[2]Noguchi N, Noiri Y, Narimatsu M, et al. Identi fi cation and localization of extraradicular bio fi lm-forming bacteria associated with refractory endodontic pathogens[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(12):8738-8743.

[3]Leonardo MR, Rossi MA, Silva LA, et al. EM evaluation of bacterial bio fi lm and microorganisms on the apical external root surface of human teeth[J]. J Endod, 2002, 28(12):815-818.

[4]Peters LB, Wesselink PR, Moorer WR. Penetration of bacteria in bovine root dentine in vitro[J]. Int Endod J, 2000,33(1):28-36.

[5]Liu H, Wei X, Ling J, et al. Bio fi lm formation capability of Enterococcus faecalis cells in starvation phase and its susceptibility to sodium hypochlorite[J]. J Endod, 2010, 36(4):630-635.

[6]Denotti G, Piga R, Montaldo C, et al. In vitro evaluation of Enterococcus faecalis adhesion on various endodontic medicaments[J]. Open Dent J, 2009, 3:120-124.

[7]Ozdemir HO, Buzoglu HD, Calt S, et al. Effect of ethylene diaminetetraacetic acid and sodium hypochlorite irrigation on Enterococcus faecalis bio fi lm colonization in young and old human root canal dentin: in vitro study[J]. J Endod, 2010,36(5):842-846.

[8]Estrela C, Sydney GB, Figueiredo JA, et al. A model system to study antimicrobial strategies in endodontic bio fi lms[J].J Appl Oral Sci, 2009, 17(2):87-91.

[9]Arias-Moliz MT, Ferrer-Luque CM, Espigares-García M,et al. Enterococcus faecalis biofilms eradication by root canal irrigants[J]. J Endod, 2009, 35(5):711-714.

[10]Soares JA, Roque de Carvalho MA, Cunha Santos SM, et al. Effectiveness of chemomechanical preparation with alternating use of sodium hypochlorite and EDTA in eliminating intracanal Enterococcus faecalis bio fi lm[J]. J Endod,2010, 36(5):894-898.

[11]Yang SE, Cha JH, Kim ES, et al. Effect of smear layer and chlorhexidine treatment on the adhesion of Enterococcus faecalis to bovine dentin[J]. J Endod, 2006, 32(7):663-667.

[12]樊明文. 牙體牙髓病學[M]. 北京: 人民衛生出版社, 2012:343-345.

[13]Sunde PT, Olsen I, Debelian GJ, et al. Microbiota of periapical lesions refractory to endodontic therapy[J]. J Endod,2002, 28(4):304-310.

[14]Pinheiro ET, Gomes BP, Drucker DB, et al. Antimicrobial susceptibility of Enterococcus faecalis isolated from canals of root fi lled teeth with periapical lesions[J]. Int Endod J,2004, 37(11):756-763.

[15]鄭建博, 王麗娜, 宋其義, 等. 再治療根管糞腸球菌生物膜形成與臨床表現相關性分析[J]. 華西口腔醫學雜志,2012, 30(1):65-67.

[16]George S, Basrani B, Kishen A. Possibilities of gutta-perchacentered infection in endodontically treated teeth: an in vitro study[J]. J Endod, 2010, 36(7):1241-1244.

[17]郭惠杰, 岳林. 糞腸球菌在根管內定植模式的體外研究[J]. 北京大學學報: 醫學版, 2009, 41(6):699-701.

[18]Bhuva B, Patel S, Wilson R, et al. The effectiveness of passive ultrasonic irrigation on intraradicular Enterococcus faecalis bio fi lms in extracted single-rooted human teeth[J].Int Endod J, 2010, 43(3):241-250.

[19]Kania RE, Lamers GE, van de Laar N, et al. Bio fi lms on tracheoesophageal voice prostheses: a confocal laser scanning microscopy demonstration of mixed bacterial and yeast biofi lms[J]. Biofouling, 2010, 26(5):519-526.

[20]Ordinola-Zapata R, Bramante CM, Graeff MS, et al. Depth and percentage of penetration of endodontic sealers into dentinal tubules after root canal obturation using a lateral compaction technique: a confocal laser scanning microscopy study[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2009, 108(3):450-457.