電針對膝骨性關節炎家兔模型軟骨細胞凋亡的影響

韋桂勇 黃 劍 彭支蓮 丁 盼 肖 龍 鄭玲玲 冉 婭

(重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 400016)

膝骨性關節炎(KOA)是臨床中常見的骨關節疾病。以反復出現膝關節慢性疼痛并逐漸影響關節活動為特點。早期以關節慢性磨損而出現軟骨退行性改變，逐漸繼發滑膜和骨質的退變，導致關節功能的嚴重受損，嚴重影響患者的生活。有研究報道，細胞凋亡在關節軟骨退行性過程中起著重要的作用〔1〕。 針灸在KOA的防治方面具有獨特的療效，本研究通過觀察電針對KOA家兔模型軟骨細胞凋亡的影響，探討針刺治療KOA的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 新西蘭大白兔36只，體重2.0～2.5 kg，雌雄各半，隨機分為4組，分別為正常組(A組)、模型組(B組)、電針組(C組)、氨基葡萄糖膠囊組(D組),每組9只。由重慶醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證號為：SYXK(渝)2012-0001。

1.2實驗器械及試劑 SDZ-Ⅱ型華佗牌電子針灸儀；日本OLYMPUS公司 BX40型光學顯微鏡，BX51型正置顯微鏡。TUNEL試劑盒購于美國Roche公司；蛋白酶k購于美國Sigma公司； DAB顯色劑試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司。

1.3建立動物模型 家兔在穩定條件下飼養一周，除正常組外，其他三組參照張洪等〔2〕介紹的膝關節石膏制動法造模。剪掉三組動物左下肢踝關節以上的兔毛，左后肢伸直位用管型石膏固定，用透明膠紙封好石膏外緣，防止家兔撕咬，如果石膏脫落或松動者及時重新固定。制動6 w后，隨機從各組中抽取1只家兔處死，解剖左膝關節取關節軟骨做HE染色觀察造模情況，確認造模成功后解除石膏制動。

1.4針刺方法 動物造模成功后，參照《實驗針灸學》〔3〕和《實驗動物針灸手冊》〔4〕，以及鄭利巖等《實驗家兔經穴定位的標準化研究系列報道》〔5〕，將C組動物選取“足三里、犢鼻、血海、陽陵泉、膝眼和梁丘”六個穴位。剃除上述穴位處兔毛，常規酒精消毒后，用1寸毫針進行針刺，直刺或斜刺15～30 mm，得氣后，針柄接電針治療儀，疏密波型，頻率2～100 Hz，強度以局部皮膚肌肉輕微顫動為度。每次電針兩組，每次留針20 min，每日1次，連續治療3 w； D組：解除制動后，氨基葡萄糖膠囊溶于蒸餾水后，按90 mg/kg〔6〕口服，每天一次，共3 w。A、B組：正常飼養，不做干預。

1.5組織學檢查 治療結束后隨機從各組中抽出1只兔子處死，處死后立即切取家兔脛骨平臺關節面的完整軟骨及軟骨下骨組織標本，用10%的甲醛溶液固定48 h，脫鈣2～3 d，石蠟縱向包埋固定，常規切片，HE染色。在光鏡下學進行滑膜、軟骨細胞形態學觀察。

1.6軟骨細胞凋亡的測定 治療結束后處死各組動物，立即解剖左側膝關節，用銳刀片切1 cm×1 cm 取股骨內髁全層軟骨，置10%多聚甲醛固定48 h后，常規切片，厚度為5 μm，置于40℃水浴展片，撈片后于60℃烘烤箱中烘片2 h以使切片緊密黏附，按照試劑盒說明，采用原位末端標記法(TUNEL)測定軟骨細胞凋亡。陽性判定：細胞核為棕黃色顆粒。 每張切片隨機選取5個視野，計數陽性細胞和總細胞數。細胞凋亡指數(AI) =TUNEL標記陽性細胞數/軟骨細胞數×100%。

2 結 果

2.1病理觀察 造模后從各組家兔中隨機取出1只處死, A組解剖后觀察到：膝關節表面光滑呈淡藍色；B、C、D組動物關節軟骨面粗糙呈黃色，有骨贅增生，邊緣骨質破壞。病理切片采用HE染色，觀察發現A組動物膝關節面表層平整、光滑，軟骨細胞序列整齊，分布均勻，層次清楚。造模后B、C、D三組均出現軟骨表面不光滑、纖維化，中間層有裂隙，細胞排列紊亂，潮線不規則，簇集細胞出現。Mankin評分為6分，達到中期KOA標準〔7〕，表明造模成功。見圖1。

2.2TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡 圖2可見，家兔膝關節伸直位固定6 w后，軟骨細胞的過度凋亡，說明細胞凋亡在兔KOA發病過程中起著重要作用。C組經治療后與B組比較細胞凋亡降低，與B組比較有統計學差異(P=0.001)，說明電針能有效抑制KOA病理過程中軟骨細胞的凋亡。A組各時間段均未檢出家兔膝關節軟骨細胞的異常凋亡，AI為(4.81±0.93)%；B、C、D三組造模后軟骨細胞均過度凋亡，AI分別為(22.11±2.35)%、(17.90±1.84)%、(19.53±1.10)%，B組與A組比較有顯著差異(P<0.01)。

圖1 各組家兔模型軟骨標本HE染色

圖2 光鏡下各組家兔模型軟骨標本凋亡情況

3 討 論

本實驗采用新西蘭大白兔左后肢伸直位石膏固定法建立KOA模型，使得關節面壓力增加，導致膝關節軟骨細胞功能紊亂，軟骨與滑膜產生粘連，軟骨細胞營養缺失，從而影響軟骨的潤滑。本實驗提示膝關節已經出現中度退行性改變。因此，關節制動法造模能較好地反映KOA的臨床狀態。

正常情況下,關節軟骨細胞凋亡與增殖處于動態平衡，使關節軟骨在總體上保障其細胞數量，形態和功能的穩定。近年來發現OA存在不同程度的軟骨細胞過度凋亡，且與病變程度有關。裴明等〔8〕取OA關節軟骨經原位雜交及原位末端標記法檢測X型膠原表達及關節軟骨細胞凋亡情況，結果顯示關節軟骨退變時，軟骨細胞表達X型膠原， 同時存在軟骨細胞凋亡。Blaw等〔9〕對正常人和OA病人關節軟骨的軟骨細胞進行了研究，發現OA病人軟骨細胞中有典型的細胞凋亡，主要分布于軟骨的表層和中層，有細胞凋亡的軟骨呈現糖蛋白缺失，凋亡數量與OA分級明顯相關。認為軟骨細胞凋亡過盛可能是關節軟骨退變發展成骨關節病的重要原因之一。胡建華等〔10〕在對骨關節炎患者關節軟骨細胞凋亡的基因調控研究中發現，患者關節軟骨細胞的bax mRNA表達上調的同時，bcl-2 mRNA表達也顯著增高，認為bcl-2和bax共同調節了軟骨細胞的凋亡。本研究表明家兔KOA模型造模過程實際上是膝關節軟骨細胞的過度凋亡的過程，電針是通過抑制家兔KOA模型軟骨細胞的過度凋亡，改善膝骨關節軟骨的退變，從而達到治療效果。

KOA屬中醫學痹證范疇，《靈樞·九針》曰：“五勞所傷，久立傷骨，久行傷筋，久坐傷肉”的記載。《靈樞》云:“經脈者，所以行血氣而營陰陽，濡筋骨，利關節者也。”“血和則經脈流行，營復陰陽，筋骨勁強，關節清利矣。”筆者認為KOA多與機體正氣不足，肝腎虧虛，筋骨失養，夾雜風寒濕邪痹阻有關。其主要病機是“虛與阻”,虛主要是血虛、肝腎虛；阻主要是血瘀氣滯，寒凝等。治療宜溫經通絡、行氣止痛，補肝腎為主。KOA在臨床上采用針灸進治療，療效獨特。姚志芳等〔11〕在臨床上采用溫針灸血海、梁丘、陰陵泉、陽陵泉、足三里等穴治療KOA與單純針刺法療比較，結果發現溫針灸組的療效優于單純針刺組，尤其是對KOA寒痹型患者。谷建林〔12〕用溫針灸加中藥治療KOA 46例，結果顯效15例，有效25例，無效6例，總有效率86.9%。溫針灸能使溫熱之氣透達促進膝關節的局血循環，祛寒除濕，活血祛瘀，具有止痛和緩解癥狀的作用。何新芳等〔13〕研究針刀療法對KOA兔關節軟骨細胞凋亡的影響，結果表明針刀療法能抑制兔KOA軟骨細胞的凋亡，促進關節軟骨形態恢復。

針灸治療能通過對患者膝關節周圍穴位的刺激，促進機體釋放內源性嗎啡呔等鎮痛物質，提高痛閾，達到鎮痛的目的。電針治療，能使肌肉一收一舒，起到泵的作用，從而改善局部血液循環，促進經氣運行，有利于對滲出液的吸收，有利于關節面軟骨的修復。本研究根據經絡臟腑辯證，選取“足三里、犢鼻、血海、陽陵泉、膝眼和梁丘”六個穴進行治療。足三里、犢鼻循行經過膝關節，同為足陽明胃經穴位，局部取穴有鼓舞氣血、舒筋通絡的作用。血海為生血、活血的重要穴位。膝者筋之府，陽陵泉為八會穴中的筋會，與足三里、犢鼻、血海相配有養血通絡，舒筋利關節的作用。

4 參考文獻

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