苗醫推拿對緩解期哮喘兒童IFN-γ、IL-4、IL-17的影響及表觀遺傳學機制

中正

1.吉首大學醫學院，湖南 吉首 416000;2.吉首大學數學與統計學院2012級統計學研究生,湖南 吉首 416000

苗醫推拿對緩解期哮喘兒童IFN-γ、IL-4、IL-17的影響及表觀遺傳學機制

石維坤1李艷2李中正1

1.吉首大學醫學院，湖南 吉首 416000;2.吉首大學數學與統計學院2012級統計學研究生,湖南 吉首 416000

目的觀察苗醫推拿治療緩解期兒童哮喘的臨床療效及對免疫平衡的影響，并初步探討其表觀遺傳學機制。方法30例健康兒童為健康對照組。30例哮喘緩解期兒童為推拿組，比較推拿前后兒童哮喘控制測試(C-ACT)評分，檢測血清Th1、Th2及Th17的代表性細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17的含量及外周血CD4+T細胞的組蛋白乙酰轉移酶(HAT)及組蛋白去乙酰化酶(HDAC)的活性。結果苗醫推拿總有效率達93.34%，可升高血清IFN-γ水平，同時降低IL-4及IL-17水平，并抑制HAT活性，同時增強HDAC活性(均P<0.05)。結論苗醫推拿治療緩解期兒童哮喘療效肯定，能有效調節免疫平衡。組蛋白乙酰化修飾等表觀遺傳學機制可能在其中發揮了一定作用。

湘西劉氏小兒推拿；哮喘；IFN-γ；IL-4；IL-17；表觀遺傳學

兒童支氣管哮喘是目前臨床常見的慢性呼吸道疾病，有反復發作、纏綿難愈的特點[1]。經典理論認為Th1型免疫反應減弱而Th2型免疫反應異常增強在哮喘的發病過程中起到重要作用，即Th1/Th2細胞失衡學說[2-3]；近年來發現Th17細胞/Treg(調節性T細胞)的免疫失衡也是哮喘發病的重要機制之一[4]。我國已故著名推拿大師劉開運教授開創了獨具特色的苗醫“小兒推拿”[5]，稱為湘西劉氏小兒推拿流派，治療小兒肺、脾系疾病療效最為顯著[6]。本研究對比治療前后血清Th1、Th2及Th17的代表性細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17的含量，觀察苗醫推拿對緩解期哮喘兒童免疫平衡的影響；并通過檢測外周血CD4+T細胞的組蛋白乙酰轉移酶(HAT)及組蛋白去乙酰化酶(HDAC)的活性，初步探討其表觀遺傳學機制。本研究得到了吉首大學醫學倫理委員會的審查和批準(批準號：20130002)。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集吉首大學附屬中醫院(湘西土家族苗族自治州民族中醫院)門診病例30例，作為推拿組，其中男13例，女17例；土家族20例，苗族10例；年齡最小5歲，最大6歲半，平均6.45±1.18歲；病程最短6個月，最長4年，平均3.32±1.56年。納入標準：①年齡5至7歲，性別不限，民族不限；②符合緩解期兒童哮喘診斷標準[7]；③除哮喘外無其他疾病；④患兒家長或監護人簽署知情同意書。另從健康管理中心隨機收集30例健康兒童為健康對照組，要求年齡5至7歲，無過敏病史，近期無呼吸道感染史，近期未使用藥物；其中男11例，女19例；土家族18例，苗族12例；年齡最小5歲，最大7歲，平均6.74±1.48歲。2組兒童在性別、民族構成、年齡等方面差異均無顯著性(P>0.05)。

1.2 治療方法 推拿組治法為：補益脾肺、固腎納氣。患兒面向醫生站立，取其左側肢體施術，用姜汁作推拿介質，具體推治如下：常例手法(開天門、推坎宮、推太陽、按總筋、分陰陽各30次)。補腎經400次，補肺經350次，補脾經300次，清肝經250次，揉外勞宮100次，揉板門120次，揉按肺俞150次，捏脊5遍，推膻中120次，揉中脘、丹田各150次，揉按足三里120次，按肩井3次。

女童由女醫師進行推拿治療。每周治療3次(具體時間由兒童的監護人決定)，共治療3個月。治療前后分別采集哮喘患兒晨起空腹靜脈血10ml。健康對照組兒童入組后也采集晨起空腹靜脈血10ml。

1.3 觀察指標

1.3.1 兒童哮喘控制測試(C-ACT)[8]治療前后各評估一次。得分≥25分為哮喘臨床控制，20～24分為部分控制，<20分為未控制。

1.3.2 細胞因子含量檢測 IFN-γ、IL-4、IL-17試劑盒購自武漢博士德公司，酶標儀(美國Bio-Tek，ELX-800)，采用ELISA法檢測血清細胞因子的含量，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 HAT、HDAC活性檢測 淋巴細胞分離液購自上海研謹公司，分選MACS微珠(CD4)購自德國Miltenyi公司，HAT、HDAC活性試劑盒購自美國Biovision公司。對采集的靜脈血采用密度梯度離心法(Ficoll法)分離外周血單個核細胞，免疫磁珠進一步分離CD4+T細胞，ELISA法檢測吸光度。用試劑盒中一系列已知濃度的標準品繪制蛋白濃度標準曲線，計算去乙酰化賴氨酸的濃度，來代表HAT、HDAC的活性。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 推拿組臨床療效 臨床控制11例(36.67%)，部分控制17例(56.67%)，未控制2例(6.67%)，總有效率28例(93.34%)。

2.2 苗醫推拿前后血清細胞因子對比

表1 苗醫推拿前后血清IFN-γ、IL-4、IL-17對比

注：與健康對照組比較，△P<0.05；與推拿治療前比較，#P<0.05

表1結果提示：緩解期哮喘患兒血清IFN-γ、IL-4及IL-17顯著高于健康兒童(P<0.05)；苗醫推拿治療后與治療前比較，血清IFN-γ顯著升高，IL-4及IL-17顯著降低(均P<0.05)，與健康對照組比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。

2.3 苗醫推拿前后外周血CD4+T細胞HAT、HDAC活性對比

表2 苗醫推拿前后外周血CD4+T細胞HAT、HDAC活性對比

注：與健康對照組比較，△P<0.05；與推拿治療前比較，#P<0.05。

表2結果是示：與健康對照組比較，緩解期哮喘患兒外周血CD4+T細胞HAT活性增強，HDAC活性減弱(均P<0.05)；苗醫推拿治療后與治療前比較，HAT活性降低，HDAC活性增強(均P<0.05)，與健康對照組比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。

3 討論

湘西劉氏小兒推拿流派是國內著名的小兒推拿流派之一[6]，推拿名家嚴雋陶教授就推拿學源流特別指出“魯東湘西的兒科推拿”各具特色[9]。哮喘患兒緩解期主要表現為肺脾腎三臟的虛損，苗醫推拿治療緩解期哮喘以調治臟腑、增強體質、預防復發為目的，體現了中醫“未病先防、既病防變”的治未病理念。推治過程中開天門、推坎宮、推太陽、按總筋、分陰陽各30次為本流派常例“開竅”手法；推治五經根據五行生克、助制[10]之理，采用“補三抑一法”，即主補腎經，兼補肺經、次補脾經、稍清肝經，重在補腎、肺、脾三經治其本，斷其伏痰，清肝經以防肝旺乘脾侮肺；肺俞、膻中寬胸理氣，宣肺化痰；揉中脘、板門、足三里，捏脊健脾化濕；揉丹田、外勞宮溫補陽氣；按肩井“關竅”。從臨床實踐來看，苗醫推拿能有效控制哮喘，預防復發(總有效率達93.34%)。

IL-4與哮喘氣道重塑的發生存在內在關聯性；IFN-γ有利于Th1細胞的分化，而抑制Th2的分化，達到Th1/Th2的平衡狀態，從而使哮喘患者的氣道炎癥得到控制[11]；IL-17在哮喘的炎癥中發揮重要作用，表達水平與哮喘發作程度呈正相關[12]。本研究印證了緩解期哮喘兒童Th1/Th2平衡紊亂、Th1及Th17應答增強，并證實了苗醫推拿能夠調節Th1/Th2平衡，下調IL-17含量(均P<0.05)。

表觀遺傳學的改變在哮喘的發病機制中起著重要作用[13]。表觀遺傳學研究不涉及DNA序列改變的基因表達調控，主要包括組蛋白修飾、DNA甲基化與非編碼調節性RNA調控。組蛋白修飾包括乙酰化、甲基化和磷酸化等，其中乙酰化及去乙酰化修飾研究較多，是動態的可逆的修飾。HAT促進組蛋白乙酰化和相關基因的轉錄，而HDAC促進組蛋白去乙酰化，抑制相關基因轉錄。哮喘患者支氣管肺泡灌洗液巨噬細胞及活檢肺組織標本中HAT活性增強伴隨HDAC活性降低[14]，外周血單個核細胞也存在同樣的改變[15]。本研究結果顯示，苗醫推拿治療3個月后，患兒外周血CD4+T細胞HAT活性顯著降低而HDAC活性顯著升高(均P<0.05)，說明苗醫推拿可抑制HAT活性，增強HDAC活性，減弱組蛋白乙酰化，這可能是其調節哮喘患兒免疫平衡的表觀遺傳學機制之一，但能否長期保持這種表觀遺傳學狀態，還需要進一步研究。

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湖南省中醫藥管理局科研課題(項目編號：2013104)。

李中正(1985- )，男，土家族，湖南慈利人，碩士，講師，執業中醫師，主要從事推拿學的教學科研工作。

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1007-8517(2014)07-0011-02

2014.01.06)