聯苯菊酯與腫瘤相關DNA相互作用的光譜研究*

卜曉陽，李 萍，何寶佳，楊小弟

(1.皖南醫學院 藥學院，安徽 蕪湖241002；2.南京師范大學 化學與材料科學學院，江蘇 南京210097)

聯苯菊酯(Bifenthrin，結構式見圖1)是一種典型的擬除蟲菊酯類農藥，此類農藥因具有高效、安全、廣譜等特點，被廣泛使用于農業生產和家庭生活中.擬除蟲菊酯農藥作為一種神經毒物，其作用機制一直是毒理學研究的熱點.研究發現多種疾病的發生與擬除蟲菊酯農藥的暴露有關，它具有一定的慢性毒性，是人類健康潛在的威脅物［1-2］.有些擬除蟲菊酯農藥品種甚至有致癌、致畸、致基因突變作用［3-4］.腫瘤的發生大部分是與人體內某些基因的異常表達有關.p53 DNA是一種腫瘤抑制基因，人體中功能正常的p53 DNA能阻止多種腫瘤發生，而p53 DNA自身結構的改變是導致其抑癌功能喪失的主要原因［5］.另外，C-myc DNA是一種癌基因，能促進細胞分裂，研究表明多種腫瘤疾病中都發現有C-myc DNA的表達異常［6-7］.

圖1 聯苯菊酯的結構式(BF)

本文主要利用光譜學手段探討聯苯菊酯與兩種腫瘤基因之間的作用機制，主要是研究兩者之間的作用模式和對DNA空間結構的影響，以期從分子水平上了解聯苯菊酯對人類腫瘤相關基因的影響，為揭示農藥生物毒理性和腫瘤疾病的預防和治療提供新的線索.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Cary-5000紫外光譜儀(美國Varian公司)；LS50B型熒光光譜儀(美國 Perkin Elmer公司)；SevenMulti pH離子綜合測試儀(瑞士Mettler Toledo公司)；HH-2數顯式恒溫水浴鍋(常州國華電器公司).實驗所用DNA(上海生工生物技術公司)序列為：p53 DNA ss1：5′-CCTCCTCCCCAACTCC-3′；ss2：3′-GGAGGAGGGGTTGAGG-5′；C-myc DNA：ss1：5 ′-GGGAGGGTGGGGAAGG-3 ′；ss2：3 ′-CCCTCCCACCCCTTCC-5.聯苯菊酯為標準品(德國Dr.Ehrenstorfer公司)；溴化乙啶(EB)(上海生工生物技術公司)；其它試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水.

1.2 雙鏈DNA的配置

用2條互補單鏈DNA(5×10-4mol/L)配置成雙鏈DNA的磷酸鹽緩沖液(0.5mol/L，pH=7.3)，在85℃下，退火12min，緩慢冷卻到25℃，得到雙鏈DNA溶液濃度為5×10-4mol/L.

1.3 實驗方法

紫外光譜實驗：用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.3)配制聯苯菊酯溶液，得到聯苯菊酯溶液濃度為1.0×10-4mol/L和5.0×10-4mol/L，逐漸將不同體積的聯苯菊酯溶液滴加到500μL濃度為5.0×10-6mol/L DNA的磷酸鹽緩沖液(pH=7.3)中，使DNA與聯苯菊酯的摩爾比為4：1～1：4，測量DNA溶液在190～500nm處紫外吸收光譜的變化.參比溶液為0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.3).

變溫實驗：將5.0×10-6mol/L的DNA溶液和5.0×10-4mol/L的聯苯菊酯溶液等摩爾混合，在37℃下恒溫3h，然后進行程序升溫.參比溶液為0.1mol/L磷酸鹽緩沖液.測定在25～90℃溫度范圍內溶液在260nm處的吸光度(A260nm).升溫速率為2℃/min.

EB-DNA熒光猝滅實驗：將DNA與EB溶液混合得到EB-DNA混合體系，再分別加入不同劑量的聯苯菊酯溶液，使聯苯菊酯與DNA的摩爾比為1：1 ～8：1，測定聯苯菊酯加入后對 EB-DNA 體系的熒光影響情況.熒光激發和發射狹縫寬度均為5nm.

離子強度影響實驗：將DNA與EB、NaCl三種溶液混合，得到NaCl-EB-DNA的三元溶液體系，滴加不同體積的聯苯菊酯溶液，使聯苯菊酯與DNA摩爾比為1：1～8：1，測其對該三元溶液體系的熒光影響.與EB-DNA體系的猝滅效應作比較.熒光激發和發射狹縫寬度均為5nm.

2 結果與討論

2.1 聯苯菊酯與DNA相互作用的紫外滴定實驗

將不同體積的聯苯菊酯逐漸滴加至DNA溶液中，DNA溶液的紫外吸收光譜變化如圖2所示.由圖可見，隨著DNA與聯苯菊酯的濃度比從4：1遞減至1：4，DNA在260nm處的特征吸收峰呈減色效應，但吸收峰的位置無明顯位移，一般來說，對于典型的嵌插，由于DNA的π電子和小分子的π電子會發生堆積作用，可出現紫外減色效應和紅移現象，如果是靜電或溝槽作用就會表現為吸收峰小幅紅移但強度無明顯改變.圖中，聯苯菊酯加入后，DNA的紫外吸收峰呈有規律的減色但無紅移現象，這說明聯苯菊酯和兩種DNA之間均存在相互作用，但并非完全的嵌插作用，可能為較弱的部分嵌插.

圖2 DNA與聯苯菊酯按4：1～1：4濃度比混合后溶液的紫外吸收光譜A：p53 DNA；B：C-myc DNA

2.2 聯苯菊酯與DNA相互作用的紫外升溫實驗

DNA熔點溫度(Tm)的變化可以用來判斷其雙螺旋結構的穩定性.小分子與DNA結合模式會影響DNA的Tm.典型的嵌插作用能提高DNA雙螺旋穩定性，會使其Tm值升高7～8℃；本實驗中，在25～90℃范圍內，通過紫外光譜儀的程序升溫，測定聯苯菊酯加入前后DNA在260nm處紫外吸收峰強度的變化，并利用Boltzmann函數擬合計算出DNA的解鏈溫度Tm，結果如表1所示.由表1看出，聯苯菊酯的加入使p53 DNA的Tm升高3.6℃；使C-myc DNA的Tm升高1.9℃，這可能由于聯苯菊酯以弱的嵌插作用與兩種DNA作用，一定程度上增強了DNA結構的穩定性.并且p53 DNA的Tm變化較C-myc DNA的更大，說明聯苯菊酯與p53 DNA的結合能力更強.

表1 加入有機氯農藥分子前后的DNA的Tm值

2.3 聯苯菊酯與DNA相互作用的EB-DNA熒光猝滅實驗

溴化乙錠(EB)是一種熒光染料，它能典型地嵌入雙螺旋DNA的堿基對中使其熒光顯著增強.本實驗利用EB作為p53 DNA和C-myc DNA的熒光探針，向EB-DNA溶液中逐步加入聯苯菊酯，根據EB-DNA體系是否發生熒光猝滅來判斷聯苯菊酯能否競爭置換出EB，從而與DNA發生嵌插作用.聯苯菊酯與EB-DNA體系的熒光猝滅圖譜見圖3.

圖3 聯苯菊酯與EB-DNA熒光猝滅圖譜

由圖可見，聯苯菊酯加入后，EB-DNA體系的熒光逐漸減弱，當DNA與聯苯菊酯的摩爾比從1：1減小到1：8時，EB-p53體系發生25.43%的猝滅，EB-C-myc體系發生22.89% 的猝滅，當聯苯菊酯濃度繼續增大后，EB-DNA體系熒光無明顯減小，這說明聯苯菊酯對EB的競爭作用已達飽和，聯苯菊酯無法完全競爭出嵌插進DNA中的EB，只能發生部分嵌插作用.

由 Stern-Volmer方程(F0/F=1+Kq·τ0［Q］，F0為EB-DNA系的初始熒光強度，F為EB-DNA體系加入聯苯菊酯溶液后的最終熒光強度，Kq為猝滅速率，［Q］為猝滅劑濃度，τ0為生物分子的熒光壽命，約為10ns)計算相關常數(Ksv：猝滅常數；Kq：猝滅速率；n：結合位點數)，結果見表2.表中聯苯菊酯與EB-DNA體系結合位點均小于1，猝滅常數較小等數據進一步證實聯苯菊酯與DNA為弱的部分嵌插結合.

表2 聯苯菊酯與EB-DNA體系作用的相關常數

2.4 聯苯菊酯與DNA相互作用的離子強度影響實驗

紫外滴定實驗和EB-DNA競爭實驗的結果表明聯苯菊酯與DNA之間存在著嵌插作用，而小分子與DNA的相互作用有可能受多種作用的共同影響.當小分子與DNA之間是以靜電作用時，改變離子強度，引入的帶電正離子可以中和DNA磷酸骨架上的負電荷，競爭了小分子與DNA的嵌插作用，從而減弱熒光猝滅程度.因此可以在熒光實驗中改變溶液的離子強度，以此來判斷小分子與DNA分子之間是否有靜電作用.本實驗利用強電解質NaCl來控制聯苯菊酯與DNA體系的離子強度，實驗結果如表3所示.表中猝滅率(Quenching rate)=(F0-F)/F0×100%，其中F0為NaCl-EB-DNA的初始熒光強度，F為NaCl-EB-DNA體系加入聯苯菊酯溶液后的最終熒光強度.

表3 NaCl對聯苯菊酯與EB-DNA體系作用的影響

結果表明，加入NaCl以后，兩種DNA體系均增大了3%左右，說明加入NaCl增強了聯苯菊酯對EB-DNA體系的猝滅行為.這說明離子強度沒有競爭影響聯苯菊酯與DNA間的結合作用，它們之間不存在靜電作用，可能由于加大離子強度為聯苯菊酯提供了更好的疏水環境，這樣有利于聯苯菊酯與DNA雙螺旋之間的嵌插作用，導致了熒光猝滅現象輕微的加強.

3 結論

運用紫外和熒光光譜法探討聯苯菊酯與兩種腫瘤相關DNA之間的相互作用，紫外滴定實驗結果出現減色現象和無明顯紅移，表明聯苯菊酯和DNA之間可能是非完全的嵌插作用.紫外變溫實驗表明，聯苯菊酯的結合能引起DNA熔點溫度升高，增強了DNA分子的熱穩定性.EB競爭實驗進一步證明DNA與聯苯菊酯是部分嵌插結合；離子強度實驗說明聯苯菊酯與DNA之間不存在靜電作用.綜上所述，聯苯菊酯與兩種腫瘤相關DNA均以弱的嵌插作用結合，且與p53 DNA的結合能力稍強于與C-myc DNA的結合能力.

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