HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地茯苓中的茯苓酸含量*

張 穎，江玲麗

(安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，安徽蕪湖241000)

茯苓為多孔菌科真菌茯苓［Poria cocs(Schw)Wolf］的干燥菌核，具有利水消腫、健脾安神的療效［1］，其主要成分茯苓多糖和萜類成分還可用于抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫［2］.中國(guó)茯苓資源豐富，全國(guó)多地均有出產(chǎn)，但各產(chǎn)區(qū)藥材質(zhì)量良莠不齊，甚至出現(xiàn)以次充好的現(xiàn)象［3］.傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為云南茯苓是各產(chǎn)地中質(zhì)量最好的，而安徽、湖北產(chǎn)量較大［4］.在安徽岳西一帶，當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)認(rèn)為地產(chǎn)茯苓的質(zhì)量?jī)?yōu)于云南茯苓，且在性狀方面有與其它各產(chǎn)地不同之處，如色白如玉、氣味芬芳［5］.現(xiàn)存文獻(xiàn)較多關(guān)注于云南茯苓［6］.本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大了樣本的產(chǎn)地范圍，比較了包括主要和次要產(chǎn)地的11個(gè)產(chǎn)區(qū)的茯苓藥材中茯苓酸的含量，意在將全國(guó)范圍內(nèi)各產(chǎn)地的茯苓藥材中主要成分做對(duì)比，整體上反應(yīng)地域氣候?qū)蜍咚幉牡挠绊?，進(jìn)一步完善茯苓藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).

1 材料與儀器

1.1 儀器

美國(guó)進(jìn)口waters E600高效液相色譜儀(waters 2489 UV/Visble Detector，浙江大學(xué)N2000色譜工作站)；上海越平儀器廠產(chǎn)FA21048型分析天平；蘇州愛拓瑪機(jī)械公司產(chǎn)ATM40-1B超聲波清洗機(jī).

1.2 藥材

收集了全國(guó)11個(gè)產(chǎn)區(qū)的茯苓藥材，經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥教研室劉學(xué)醫(yī)老師鑒定為多孔菌科真菌茯苓［Poria cocs(Schw)Wolf］的干燥菌核.分別編號(hào)如下：A：安徽岳西；B：廣西龍勝；C：湖北英山；D：云南榕豐；E：河南周始；F：四川西昌；G：貴州黃平；H：湖南靖州；I：浙江景寧；J：福建永泰；K：江西樟樹.

1.3 試劑

乙腈為色譜純，南京試劑一廠生產(chǎn)；磷酸為色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)；水為娃哈哈純凈水；對(duì)照品茯苓酸為上海純優(yōu)生物科技有限公司提供，批號(hào)201301P0734.

2 方法

2.1 色譜條件

waters symmetry C18(5μm，4.6 ×150mm).檢測(cè)波長(zhǎng)為243nm，柱溫25℃.流動(dòng)相為乙腈和0.5%磷酸水溶液混合梯度洗脫［7］，條件如表1所示.采用外標(biāo)法計(jì)算含量，HPLC圖譜見圖1.

表1 HPLC梯度洗脫條件

圖1 HPLC色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取茯苓酸對(duì)照品適量，用甲醇充分溶解，定容至10ml容量瓶中，搖勻即得濃度為0.13mg/ml的茯苓酸對(duì)照品溶液，0.45μm的微孔濾膜過濾待用.

2.3 供試品溶液的制備

將茯苓藥材低溫干燥后粉碎，過50目篩，精密稱取約0.5g，置于100ml具塞錐形瓶中，定量加入甲醇50ml，密塞，稱定質(zhì)量后，超聲提取30min，取出冷卻后，加甲醇補(bǔ)足損失的重量，靜置后取上清液用0.45μm微孔濾膜濾過待用.

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取茯苓藥材(安徽岳西)一份，按2.3方法制得供試品溶液.按2.1項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、12、24h進(jìn)樣分析，得到相應(yīng)色譜圖.記錄各色譜圖茯苓酸相應(yīng)峰面積，計(jì)算RSD=1.37%，記錄各色譜圖茯苓酸相應(yīng)峰相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算RSD=2.3%.表明供試品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定.

2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批茯苓藥材(安徽岳西)五份，按2.3方法制得供試品溶液.按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣20μl測(cè)定，得到相應(yīng)色譜圖數(shù)據(jù).計(jì)算各色譜圖茯苓酸相應(yīng)峰面積RSD=0.28%，計(jì)算各色譜圖茯苓酸相應(yīng)峰相對(duì)保留時(shí)間RSD=3.1%.結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好.

2.6 精密度試驗(yàn)

取茯苓藥材(安徽岳西)一份，按2.3方法制得供試品溶液.按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣平行測(cè)定6次，得到相應(yīng)色譜圖數(shù)據(jù).計(jì)算各色譜圖茯苓酸相應(yīng)峰面積RSD=0.49%，計(jì)算各色譜圖茯苓酸相應(yīng)峰相對(duì)保留時(shí)間RSD=2.6%.結(jié)果表明儀器精密度良好.

2.7 回收率試驗(yàn)

取已知茯苓酸含量的茯苓粉末約0.5g，精密稱定6份，加入精密稱定的茯苓酸對(duì)照品(1.0mg)，測(cè)定其回收率，結(jié)果見表2.

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性考察

精密吸取制備好的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0ml，用甲醇溶液定容至 5ml，分別進(jìn)樣 20μl，以對(duì)照液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.得回歸方程為Y=9.84X+3.71，相關(guān)系數(shù)r=0.9997.茯苓酸在0.052～1.04μg范圍內(nèi)，與峰面積呈良好線性關(guān)系.

2.9 樣品含量測(cè)定

將11個(gè)產(chǎn)地24批茯苓藥材，按2.3項(xiàng)方法制備，取20μl按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，每批平行測(cè)試3次，外標(biāo)法計(jì)算茯苓酸含量(%)，結(jié)果見表3.

3 討論

(1)本實(shí)驗(yàn)嘗試多種色譜條件，在綜合文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，比較了乙腈-水，甲醇-水及乙腈-磷酸水等系統(tǒng).其中甲醇-水系統(tǒng)導(dǎo)致出峰過于集中，各個(gè)色譜峰之間分離度欠佳，不能實(shí)現(xiàn)基線分離；乙腈-水系統(tǒng)各色譜峰分離度較好，但峰型較寬，可明顯觀察到出峰拖尾導(dǎo)致保留時(shí)間后移的現(xiàn)象；乙腈-磷酸水在乙腈-水系統(tǒng)的基礎(chǔ)上添加少量磷酸，可有效改善峰型拖尾的現(xiàn)象，故選擇其為本實(shí)驗(yàn)的色譜條件，與文獻(xiàn)相吻合.

(2)本實(shí)驗(yàn)所考察茯苓產(chǎn)地基本涵蓋我國(guó)所有茯苓產(chǎn)地.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，茯苓酸含量：A：安徽岳西＞D：云南榕豐＞C：湖北英山＞F：四川西昌＞ G：貴州黃平＞B：廣西龍勝＞J：福建永泰＞K：江西樟樹＞I：浙江景寧＞E：河南周始＞H：湖南靖州，這與傳統(tǒng)用藥觀點(diǎn)及文獻(xiàn)報(bào)道基本相一致.茯苓的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)包括兩部分，鄂豫皖及云貴地區(qū)［8］，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明這兩個(gè)地區(qū)的茯苓中茯苓酸含量高于其它產(chǎn)區(qū)，單從三萜類有效成分茯苓酸含量考慮，這兩個(gè)區(qū)域的茯苓藥材質(zhì)量的確優(yōu)于其它產(chǎn)區(qū).

表3 含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

(3)比對(duì)云南、湖北、安徽三個(gè)全國(guó)茯苓主產(chǎn)區(qū)的茯苓藥材茯苓酸含量，安徽岳西所產(chǎn)茯苓略勝于其它兩個(gè)產(chǎn)地，與當(dāng)?shù)赜盟幜?xí)慣相吻合.但岳西茯苓與其它茯苓之間的性狀差別，尚需進(jìn)一步從化學(xué)成分的角度進(jìn)行分析.

(4)茯苓藥材中的茯苓酸含量與地域特點(diǎn)存在一定關(guān)聯(lián).高海拔略寒冷地區(qū)所產(chǎn)茯苓藥材含量較高，質(zhì)量較好，沿海、平原及熱帶地區(qū)所產(chǎn)茯苓藥材則含量較低，質(zhì)量欠佳.這可能與茯苓菌體生長(zhǎng)時(shí)所需溫濕度和氣壓有關(guān)，不同條件下生長(zhǎng)程度與分泌物存在一定差別.控制氣溫與濕度等條件對(duì)茯苓的規(guī)范化種植具有一定意義.

對(duì)不同產(chǎn)地茯苓藥材有效成分分析可以從根本上規(guī)范茯苓藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)，為其質(zhì)量控制提供一定依據(jù)和有力的科學(xué)保證.

［1］肖崇厚.中藥化學(xué)［M］.第1版.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1997.

［2］凌一揆，顏正華.中藥學(xué)［M］.第3版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1984.

［3］段啟，李霞蘭，王少軍，等.HPLC法測(cè)定茯苓皮中茯苓酸［J］.中草藥，2006，37(2)：284-285.

［4］任德權(quán).中藥指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)的意義和作用［J］.中藥材，2001，24(4)：235-237.

［5］丁崗，王振中，章晨峰，等.茯苓中三鐵酸類成分HPLC指紋圖譜的初步研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2002，10(10)：27-29.

［6］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［M］.第1部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［7］張思訪，劉靜涵，蔣建勤，等.茯苓的化學(xué)成分和藥理作用及開發(fā)［J］.中華實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，18(2)：227-230.

［8］鄭朝霞.茯苓飲片及其混偽品的鑒別分析［J］.中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2013(11)：131-133.