HPLC法測定草蓯蓉中齊墩果酸的含量*

張海豐，逄增玲，滕 坤，朱冰潔

(通化師范學院制藥與食品科學學院，吉林通化134002)

草蓯蓉(Boschniakia rossica Fedtsch et Flerov.)為列當科植物紫花列當或黃花列當?shù)娜菁案?分布在吉林省長白山區(qū)，系長白山珍奇植物之一.地上部分含草蓯蓉醛和草蓯蓉內(nèi)酯，又含C9、C10和C11萜內(nèi)酯，根莖含甘露醇、生物堿.一般在7、8月間采集全草，除去雜質(zhì)，洗凈泥土，鮮用或曬干后備用均可，功效補腎壯陽，潤腸，止血.主治腎虛陽痿，腰膝冷痛，老年習慣性便秘.目前國內(nèi)對于草蓯蓉中齊墩果酸含量的測定尚未見報道.本課題運用HPLC法對齊墩果酸進行了含量測定，為進一步開發(fā)利用該藥用植物資源提供科學依據(jù).

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；KQ-200KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；DHG-9101-1SA型電熱鼓風干燥箱(上海三發(fā)科學儀器有限公司)；AL104 1/10萬電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司).

野生中藥草蓯蓉，采于長白山周邊地區(qū)，經(jīng)鑒定為列當科植物草蓯蓉的全草，將樣品清洗，瀝干表面水分，置恒溫干燥箱中40℃干燥至恒重，粉碎，過40目篩，待用；齊墩果酸對照品(批號：110709-200304，含量測定用)中國藥品生物制品檢定研究院提供；水采用娃哈哈純凈水；甲醇為色譜純；其余所用試劑均為分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Agilent XDB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流動相采用甲醇 -0.3%磷酸溶液(90：10)；柱溫：室溫；檢測波長：210nm；流速：0.8ml·min-1.

2.2 供試品溶液制備

稱取樣品粉末0.5g，將其置于具塞錐形瓶中，隨后加入30ml濃度95%的乙醇溶液，并超聲提取2次，每次30min，抽濾，合并濾液至蒸發(fā)皿中，溶劑蒸干后用甲醇溶解定容至10ml容量瓶中，加95%甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取其續(xù)濾液作為樣品溶液，備用.

2.3 對照品溶液制備

稱取齊墩果酸對照品5mg，加50%甲醇定容于100ml容量瓶中，配制成每1ml含齊墩果酸0.05mg的溶液，搖勻，濾膜濾過，作為對照品溶液，備用.

2.4 樣品測定

參照“2.1”項下的色譜條件，分別吸取齊墩果酸的對照品溶液和樣品溶液各20μl進樣.在對照品溶液與樣品溶液色譜圖相應位置上，有相同的保留時間(圖1).按外標法計算峰面積，即得.結(jié)果見表1.

表1 草蓯蓉中齊墩果酸的含量(n=3)

圖1 草蓯蓉HPLC色譜圖

2.5 線性關系考察

精密吸取齊墩果酸的對照品溶液 2、4、6、8、10、20ml，分別置于10ml量瓶中，50%甲醇定容，搖勻，得到不同濃度的對照品混合溶液，再精密吸取上述對照品溶液各20μl，參照“2.1”項下的色譜條件測定峰面積，以峰面積Y為縱坐標，對照品濃度X(μg/ml)為橫坐標，繪制標準曲線(圖2)，齊墩果酸回歸方程為：Y=0.3617X+11.129，r=0.9991(n=6).結(jié)果表明，齊墩果酸的進樣量在0.2451～2.451μg范圍內(nèi)與峰面積響應值呈現(xiàn)良好的線性關系.

圖2 齊墩果酸標準曲線

2.6 精密度試驗

精密吸取上述的對照品溶液，參照“2.1”項下的色譜條件，重復進樣5次，每次10μl，齊墩果酸的峰面積積分值相對標準偏差RSD為1.09%，說明本方法精密度良好.

2.7 穩(wěn)定性試驗

參照“2.1”項下的色譜條件，精密吸取“2.2”項下的樣品溶液分別于 0、2、4、8、12、24h 測定，記錄峰面積值.結(jié)果齊墩果酸的色譜峰面積無明顯改變，RSD為1.28%，表明樣品溶液的穩(wěn)定性良好.

2.8 加樣回收率試驗

精密吸取齊墩果酸的對照品溶液5ml，置于150ml具塞三角錐瓶中，共設6份，于水浴上揮去溶劑后，加入6份已知含量草蓯蓉各0.5g(齊墩果酸含量為0.4698mg/g)，按上述方法進行提取、測定，計算加樣回收率.結(jié)果見表2.

3 討論

3.1 提取方法選擇

本文選用甲醇和不同濃度的乙醇作為提取溶劑，分別進行加熱回流提取和超聲提取，結(jié)果顯示50%乙醇超聲提取30min，方法操作簡便、快速，提取率高.

3.2 色譜方法的建立

通過查閱參考文獻以及進行預實驗，分別比較了甲醇-0.3%磷酸水溶液(90：10)、甲醇-0.1%冰醋酸溶液(85：15)、甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液(23：42：35)、乙腈 -0.1%磷酸水溶液(85：15)等不同配比的流動相，通過反復摸索最終確定流動相為甲醇-水溶液(90：10)，用此流動相分離效果較好，并選用 Agilent XDB-C18色譜柱，檢測波長210nm，將流速從 1ml·min-1降為 0.8ml·min-1使與相鄰峰能達到基線分離，無重疊峰，R＞1.5，穩(wěn)定，重現(xiàn)性好.

表2 加樣回收率的實驗結(jié)果(n=6)

［1］韓志慧，劉國際，雒廷亮.HPLC法測定齊墩果酸片中齊墩果酸的含量［J］.鄭州大學學報，2005，26(4)：51-56.

［2］戰(zhàn)佩英，周麗莉，黃永.HPLC法測定女貞子中齊墩果酸含量實驗條件的探索［J］.通化師范學院學報，2007，28(8)：46-48.

［3］謝樂，馬曉黎，劉麗芳，等.HPLC測定不同產(chǎn)地威靈仙中齊墩果酸的含量［J］.中成藥，2009，31(1)：100-103.

［4］顧學芳，田澍，黃丹.苦丁茶中熊果酸和齊墩果酸的提取及含量測定［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29(5)：96-98.