谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶P1基因多態(tài)性與兒童ALL HD-MTX不良反應(yīng)的關(guān)系*

任艷飛 袁秀麗 岳麗杰 鄒澤巧 謝 偲 丁 慧 宋 萍劉 暢

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶P1基因多態(tài)性與兒童ALL HD-MTX不良反應(yīng)的關(guān)系*

任艷飛①袁秀麗②岳麗杰①鄒澤巧①謝 偲①丁 慧①宋 萍③劉 暢①

目的：研究谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione S-transferase pi，GSTP1）基因多態(tài)性與兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）使用大劑量甲氨蝶呤（high-dose methotrexate，HD-MTX）化療后不良反應(yīng)的關(guān)系。方法：應(yīng)用巢式PCR（Nest PCR）、變性梯度凝膠電泳（denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE）和DNA直接測序技術(shù)檢測51例兒童ALL GSTP1基因型和等位基因分布頻率，按美國國立癌癥研究所的常規(guī)毒性判定標(biāo)準(zhǔn)（NCICTCAE）對HD-MTX不良反應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果：篩查出3個GSTP1 SNPs位點即rs1695（A313G）、rs1138272（G439T）和rs4891（T555C）。rs1695/rs4891多態(tài)性位點包括32例（62.7%）野生型、16例（31.4%）雜合型和3例（5.9%）純合型，rs1138272多態(tài)性位點僅包括1例（2.0%）雜合型和1例（2.0%）純合型。3個SNPs位點等位基因頻率分別為21.6%、2.9%和21.6%。GSTP1 rs1695/rs4891多態(tài)性位點中AG+GG/TC+CC基因型與外周血血紅蛋白減少有關(guān)（OR=0.25，95%CI=0.06～1.00，P=0.049），GSTP1 rs1695/rs4891多態(tài)性位點中AG+GG/TC+CC基因型與高危組患兒胃腸毒性發(fā)生有關(guān)（OR=0.125，95%CI=0.02～0.78，P=0.026）。結(jié)論：GSTP1 rs1695/rs4891多態(tài)性與ALL兒童HD-MTX化療后外周血血紅蛋白降低以及中高危組ALL兒童發(fā)生胃腸毒性有關(guān)。

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 基因多態(tài)性 急性淋巴細(xì)胞白血病 甲氨蝶呤 不良反應(yīng)

大劑量甲氨蝶呤（high-dose methotrexate，HD-MTX）在兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）治療和長期生存中發(fā)揮重要作用，尤其是在常規(guī)預(yù)防髓外白血病中，已成為兒童ALL治療成功的關(guān)鍵。與此同時，ALL兒童應(yīng)用HD-MTX后出現(xiàn)的各種不良反應(yīng)仍是導(dǎo)致化療中斷最常見的原因之一，有證據(jù)表明甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生受多種藥物代謝酶基因多態(tài)性的影響［1］，本課題組已對絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（serine hydroxymethyltransferase 1，SHMT1）［2］、胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）［3］、亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）［4］等藥物代謝酶基因多態(tài)性進(jìn)行詳細(xì)探討。本研究針對51例ALL兒童的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione S-transferase pi，GSTP1）基因型和等位基因分布頻率進(jìn)行檢測，并分析GSTP1多態(tài)性與ALL兒童HD-MTX不良反應(yīng)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2007年1月至2013年12月在深圳市兒童醫(yī)院血液科確診的急性淋巴細(xì)胞白血病兒童51例；其中男33例，女18例，初診年齡為1～13歲，中位年齡為4.5歲。包括B-ALL兒童47例，T-ALL兒童4例。臨床危險度分型包括標(biāo)危ALL23例，中危ALL18例，高危ALL10例。診斷及分型參照國內(nèi)兒童ALL診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。51例ALL患兒中有43例接受GZ-2002-ALL化療方案，8例接受GD-2008-ALL化療方案，且均完成了髓外白血病的預(yù)防性化療方案。標(biāo)危和中?；純海ǔ齌-ALL患兒）接受4輪HD-MTX（2～3 g/m2）治療，高?；純海ò═-ALL患兒）接受2輪HD-MTX（5 g/m2）治療。在接受HD-MTX治療前檢查患兒一般情況有無嚴(yán)重感染；血常規(guī)、肝腎功能、心電圖、心肌酶是否正常，均符合標(biāo)準(zhǔn)后方能進(jìn)行化療。在接受HD-MTX化療同時，每晚口服6-巰基嘌呤（6-MP）25～50 mg/m2預(yù)防嘔吐；用藥結(jié)束后36h行甲酰四氫葉酸鈣解救（15 mg/m2），每6h靜脈注射一次，共6～8次，用以降低MTX毒副作用?；純夯熎陂g每日行0.1%洗必泰溶液漱口、0.05%利凡諾坐浴，用于預(yù)防口腔黏膜及肛周感染；每日思密達(dá)含漱后口服用于保護(hù)消化道黏膜。

1.2 標(biāo)本采集

經(jīng)深圳市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過及患兒監(jiān)護(hù)人同意并簽字后，于ALL兒童化療及輸血前抽取1～1.5 mL骨髓液。用QIAamp mRNA Blood-Mini Kit（QIAGEN公司，德國）抽提總RNA后，Reverse Transcriptase XL試劑盒（大連寶生物公司）逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，-20℃分裝保存。

1.3 方法

1.3.1 ALL兒童GSTP1多態(tài)性篩查 1）巢式PCR擴(kuò)增：利用Primer 5.0軟件自行設(shè)計引物［包括擴(kuò)增GSTP1（基因庫登錄號：NM_000852）全編碼區(qū)的引物和巢式PCR引物］，并在T professional Std Gradient 96擴(kuò)增儀（Biometra公司，德國）上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增體系和條件見文獻(xiàn)［6］。2）瓊脂糖凝膠電泳：將各擴(kuò)增產(chǎn)物與6×上樣緩沖液（TaKaRa公司）混合后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并在GDS800凝膠成像分析系統(tǒng)（UVP公司，美國）中拍照；3）變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）篩查及DNA測序：將上述出現(xiàn)清晰目的條帶的樣本進(jìn)行DGGE篩查，具體實驗步驟見文獻(xiàn)［6］，發(fā)現(xiàn)異常條帶的樣本送上海英濰捷基公司進(jìn)行測序。利用Chromas軟件分析測序結(jié)果。

1.3.2 MTX不良反應(yīng)統(tǒng)計指標(biāo) 本研究HD-MTX不良反應(yīng)觀察時期為每輪HD-MTX化療期間或化療后14天內(nèi)進(jìn)行評估，HD-MTX不良反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)參照美國國立癌癥研究所的第3版常規(guī)毒性判定標(biāo)準(zhǔn)（NCICTCAE，version 3.0）。刪除HD-MTX不良反應(yīng)包括骨髓抑制（外周血中性粒細(xì)胞、血紅蛋白、血小板等減少）、肝腎毒性（血清ALT、AST、肌酐、尿素氮等升高）、消化道毒性（惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等）、神經(jīng)毒性（情緒障礙、頭痛、失眠、驚厥等）、心臟毒性（心率、心律、心功能、心肌酶升高等）和口腔黏膜損傷情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。用基因計數(shù)法統(tǒng)計ALL兒童GSTP1多態(tài)性位點的基因型和等位基因分布頻率；用χ2檢驗（Chi-square Test）判定該多態(tài)性基因型和等位基因頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡；用Logistic回歸分析兒童ALL GSTP1多態(tài)性與HD-MTX不良反應(yīng)間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HD-MTX相關(guān)不良反應(yīng)及分級

參照NCICTCAE，version 3.0，本研究中51例ALL兒童接受HD-MTX化療后出現(xiàn)的主要不良反應(yīng)及分級情況見表1。治療期間ALL兒童均未出現(xiàn)死亡病例。

2.2 ALL兒童GSTP1多態(tài)性篩查結(jié)果

經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增、DGGE篩查和DNA測序?qū)?1例ALL兒童GSTP1全編碼區(qū)多態(tài)性進(jìn)行篩查，共發(fā)現(xiàn)3個SNPs位點即rs1695（A313G）、rs1138272（G439T）和rs4891（T555C）。3個多態(tài)性位點的基因型和等位基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P＞0.05）。rs1695和rs4891兩個多態(tài)性位點的基因型及等位基因分布頻率相同，包括野生型32例（62.7%）、雜合型16例（31.4%）和純合型3例（5.9%），G/C等位基因頻率為21.6%。rs1138272（G439T）位點僅篩查出1例GT雜合型（2.0%）和1例TT純合型（2.0%），其余均為GG野生型，其T等位基因頻率為2.9%。由于rs1138272多態(tài)性位點突變例數(shù)較少（僅2例），故不對該位點多態(tài)性進(jìn)行不良反應(yīng)分析。3個SNPs位點DGGE圖和DNA測序結(jié)果見圖1和圖2。

表1 51例ALL患兒HD-MTX治療后的不良反應(yīng) 例（%）Table 1 Toxicities in 51 ALL children treated with HD-MTX n%

圖1 GSTP1 rs1695、rs4986949、rs4891多態(tài)性DGGE圖Figure 1 DGGE diagram of rs1695,rs4986949,and rs4891 polymorphisms of GSTP1

2.3 GSTP1多態(tài)性與HD-MTX不良反應(yīng)的關(guān)系

本研究將出現(xiàn)HD-MTX相關(guān)不良反應(yīng)包括骨髓抑制（外周血中性粒細(xì)胞、血紅蛋白和血小板減少）（≥2級［7］）、消化道毒性（≥2級［7］）、口腔黏膜損傷（≥2級［7］）和肝臟毒性（≥1級［3］）與GSTP1 rs1695/rs4891多態(tài)性比較分析，發(fā)現(xiàn)GSTP1 rs1695/rs4891多態(tài)性位點中AG+GG/TC+CC基因型與外周血血紅蛋白減少有關(guān)（OR=0.25，95%CI=0.06～1.00，P=0.049），結(jié)果見表2；除此之外，rs1695/rs4891各基因型與ALL兒童HD-MTX其他不良反應(yīng)（包括外周血中性粒細(xì)胞減少、血小板減少、肝臟毒性、胃腸毒性和口腔黏膜損傷，此處不良反應(yīng)指除血紅蛋白減少以外的不良反應(yīng)）間不存在相關(guān)性（P＞0.05）。

中高危患兒GSTP1 rs1695/rs4891多態(tài)性位點中AG+GG/TC+CC基因型和野生型發(fā)生胃腸毒性的頻率分別為20.0%和66.7%，兩者間差異性具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.018）。并且，攜帶rs1695/rs4891多態(tài)性位點中AG/TC基因型和AG+GG/TC+CC基因型的ALL兒童發(fā)生胃腸毒性的可能性是野生型的0.143倍（OR=0.143，95%CI=0.02～0.91，P=0.039）和0.125倍（OR=0.125，95%CI=0.02～0.78，P=0.026）。而標(biāo)危組和中高危組的其他不良反應(yīng)與GSTP1 rs1695/rs4891各基因型無相關(guān)性（表3，4）。

圖2 GSTP1 rs1695、rs4986949、rs4891多態(tài)性DNA測序圖Figure 2 DNA sequencing diagram of rs1695,rs4986949,and rs4891 polymorphisms of GSTP1

表2 51例ALL患兒GSTP1 rs1695/rs4891與HD-MTX引起的血紅蛋白減少的關(guān)系 例（%）Table 2 Association between GSTP1 rs1695/rs4891 genotype and HD-MTX-related hemoglobin in 51 children with ALL n%

表3 GSTP1 rs1695/rs4891突變基因型與HD-MTX不良反應(yīng)的關(guān)系Table 3 Association between GSTP1 rs1695/rs4891 mutation genotype and HD-MTX-related toxicity

表4 中高危ALL患兒GSTP1 rs1695/rs4891與HD-MTX引起的胃腸毒性關(guān)系 例（%）Table 4 Association between GSTP1 rs1695/rs4891 genotype and HD-MTX-related gastrointestinal toxicity in intermediate-risk and high-risk children with ALL n%

3 討論

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione s-transferases pi，GSTP1）在多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，是參與兒童ALL化療藥物MTX代謝的一類重要的Ⅱ相解毒代謝酶。通過催化親電子性藥物（如MTX）與谷胱甘肽（GSH）等親水性底物結(jié)合，降低GSH復(fù)合物毒性而發(fā)揮解毒作用。HD-MTX對處于對數(shù)增殖期的細(xì)胞具有較強抑制作用，由于其作用無靶向性，對除腫瘤外的其他增殖期細(xì)胞同樣具有殺傷作用，故在臨床上表現(xiàn)為一系列不良反應(yīng)，包括骨髓抑制、肝、腎及胃腸毒性、口腔黏膜損傷和短暫或持續(xù)性神經(jīng)毒性［8］。

本研究經(jīng)DGGE和DNA直接測序方法共發(fā)現(xiàn)2個非同義突變rs1695（A313G）、rs1138272（G439T）和1個同義突變rs4891（T555C），目前國內(nèi)尚未見到有關(guān)rs1138272和rs4891多態(tài)性位點的報道。這3個SNPs位點rs1695、rs1138272和rs4891等位基因在兒童ALL中的分布頻率分別為21.6%、2.9%和21.6%。Huang等［9］對GSTP1多態(tài)性在兒童ALL中的分布進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)rs1695等位基因突變頻率在亞洲患兒中為23.8%，在白種患兒中為27.8%，與本研究結(jié)果相近，說明GSTP1 rs1695等位基因型分布無明顯種族差異性（P＞0.05）。另外，本研究結(jié)果顯示rs1695與rs4891的基因型及等位基因頻率均相同，參考Timofeeva等［10］對非同義突變rs1695和同義突變rs4891多態(tài)性的研究結(jié)論，推測rs4891和rs1695可能為高度連鎖不平衡，故應(yīng)擴(kuò)大樣本量和樣本范圍并做進(jìn)一步討論。

目前國內(nèi)外有大量針對GSTP1多態(tài)性與兒童白血病發(fā)病、化療敏感性關(guān)系的研究［9，11-13］，但有關(guān)GSTP1多態(tài)性與兒童ALL化療不良反應(yīng)相關(guān)性的報道則較為少見，其中GSTP1多態(tài)性與兒童ALL化療后出現(xiàn)骨髓抑制關(guān)系的研究尚未見有關(guān)報道。故本研究主要針對GSTP1 3個基因多態(tài)性rs1695、rs1138272和rs4891與ALL兒童HD-MTX化療不良反應(yīng)間相關(guān)性進(jìn)行研究分析。

臨床上骨髓抑制是HD-MTX化療后不良反應(yīng)中較為嚴(yán)重的一種，主要表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞、血紅蛋白和血小板的減少。本研究發(fā)現(xiàn)GSTP1 rs1695/rs4891多態(tài)性位點中AG+GG/TC+CC基因型對外周血血紅蛋白起保護(hù)作用，有降低ALL兒童發(fā)生貧血不良反應(yīng)的可能性（OR=0.25，95%CI=0.06～1.00，P=0.049）；而HD-MTX其他相關(guān)不良反應(yīng)與GSTP1各基因型則不具有相關(guān)性（P＞0.05）。另外，本研究中高危組患兒攜帶GSTP1 rs1695/rs4891 AG+GG/TC+CC基因型者發(fā)生胃腸毒性的概率是野生型GSTP1的0.125倍（OR=0.125，95%CI=0.02～0.78，P=0.026）。對于中高?；純憾?，GSTP1 rs1695/rs4891 G/C基因可作為一項預(yù)防胃腸毒性發(fā)生的保護(hù)性因素。除此之外，其他ALL危險分組中的化療不良反應(yīng)和ALL兒童的其他HD-MTX不良反應(yīng)如肝、胃腸毒性和口腔黏膜損傷均與GSTP1基因多態(tài)性無關(guān)（P＞0.05）。目前Horinouchi等［14］日本學(xué)者針對24名ALL或淋巴母細(xì)胞瘤（lymphoblastic lymphoma，LBL）兒童 GSTP1 rs1695多態(tài)性與化療肝毒性關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在肝毒性組和無肝毒性組間無顯著性差異，與本研究結(jié)果相似。

綜上所述，GSTP1 rs1695/rs4891多態(tài)性與ALL兒童HD-MTX化療后外周血血紅蛋白降低以及中高危組ALL兒童發(fā)生胃腸毒性有關(guān)。但是，考慮到HD-MTX不良反應(yīng)可能受多種藥物代謝酶的共同影響及兒童ALL納入樣本量相對較少等多方面因素影響，本研究中GSTP1單核苷酸多態(tài)性與ALL兒童HD-MTX化療后不良反應(yīng)的發(fā)生及預(yù)后的關(guān)系仍需進(jìn)一步深入調(diào)查研究。

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（2014-06-25收稿）

（2014-09-19修回）

（本文編輯：鄭莉）

Association between glutathione S-transferase pi gene polymorphism and adverse reaction of high-dose methotrexate in children with acute lymphoblastic leukemia

Yanfei REN1,Xiuli YUAN2,Lijie YUE1,Zeqiao ZOU1,Cai XIE1,Hui DING1,Ping SONG3,Chang Liu1

Lijie YUE;E-mail:2376028869@qq.com
1Laboratory of Molecular Hematology,Shenzhen Institute of Pediatrics,Shenzhen Children's Hospital Affiliated to Zunyi Medical College,Shenzhen 518026;2Department of Hematology,3Department of Emergency,Shenzhen Children's Hospital,Shenzhen 518026,China.
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.30471830)and the Shenzhen Municipal Science and Technology Project(No.201101011).

Objective:To investigate the association between glutathione S-transferase pi(GSTP1)gene polymorphism and toxicities related to high-dose methotrexate(HD-MTX)in children with acute lymphoblastic leukemia(ALL).Methods:GSTP1 genotypes and allelic frequencies in 51 children with ALL were determined by Nest PCR,denaturing gel gradient electrophoresis(DGGE),and DNA sequencing.HD-MTX adverse reactions were analyzed using the National Cancer Institute Common Toxicity Criteria(NCICTC).Results:We identified three SNPs of GSTP1,including rs1695(A313G),rs1138272(G439T),and rs4891(T555C).The wild types,heterozygous types,and homozygous types of GSTP1 rs1695/rs4891 polymorphisms were detected in 32 cases(62.7%),16 cases(31.4%), and 3 cases(5.9%),respectively.GSTP1 rs1695/rs4891 polymorphisms included only one heterozygous type and one homozygous type. The allele frequencies of the three SNPs were 21.6%,2.9%,and 21.6%.The AG+GG/TC+CC genotype of GSTP1 rs1695/rs4891 was associated with decrease in the odds of peripheral hemoglobin(OR=0.25,95%CI=0.06-1.00,P=0.049).The AG+GG/TC+CC genotype of GSTP1 rs1695/rs4891 in standard and intermediate-risk ALL children was significantly correlated with higher odds of gastrointestinal toxicity(OR=0.125,95%CI=0.02-0.78,P=0.026).Conclusion:GSTP1 rs1695(A313G)/rs4891(T555C)gene polymorphism is associated with the reduction of peripheral hemoglobin inALL children and with the odds of gastrointestinal toxicity in standard and intermediate-riskALL children who receive high-dose methotrexate.

glutathione S-transferase pi,gene polymorphism,acute lymphoblastic leukemia,methotrexate,toxicity

10.3969/j.issn.1000-8179.20141070

①遵義醫(yī)學(xué)院附屬深圳市兒童醫(yī)院兒科研究所（廣東省深圳市518026）；②血液科；③急診科

*本文課題受國家自然科學(xué)基金項目（編號：30471830）和深圳市科技計劃項目（編號：201101011）資助

岳麗杰 2376028869@qq.com

任艷飛 專業(yè)方向為兒童白血病化療藥物代謝酶的基因多態(tài)性研究。

E-mail：snyf.fei@163.com