卵巢上皮性癌中Smac蛋白的表達及臨床意義

劉俊寶，曹 璐，冷維春

（吉林大學中日聯誼醫院婦產科，吉林長春130033）

卵巢上皮性癌中Smac蛋白的表達及臨床意義

劉俊寶，曹 璐，冷維春＊

（吉林大學中日聯誼醫院婦產科，吉林長春130033）

目的探討研究Smac蛋白在正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織及卵巢上皮性癌中的表達及與卵巢上皮性癌臨床病理特征的關系。方法 隨機選取吉林大學中日聯誼醫院2008年1月－2009年10月間手術切除的卵巢組織標本，其中正常卵巢組織20例、卵巢良性上皮性腫瘤組織20例和卵巢上皮性癌組織60例。應用免疫組織化學法對組織進行染色，以檢測Smac的表達情況。結果Smac蛋白在卵巢上皮性癌組織中的表達明顯低于正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織（P＜0.05），并且Smac蛋白的表達隨著組織病理分級的升高而逐漸減弱（P＜0.05），隨著手術病理分期的升高而逐漸減弱（P＜0.05），但在不同的組織學類型中的表達無明顯差異（P＞0.05）。結論Smac的低表達可能促進卵巢癌的發生發展，可能預示著腫瘤更具有侵襲性和不良的預后。

卵巢上皮性癌；Smac蛋白；免疫組化

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1618）

近年來，卵巢惡性腫瘤已經成為病死率最高的婦科惡性腫瘤，而在卵巢惡性腫瘤中卵巢上皮性癌占到85%－90%。在我國其發病率繼續呈上升趨勢，且趨向于年輕化，同時隨之而來的腫瘤細胞耐藥問題進一步降低了患者的5年生存率。細胞凋亡是維持機體內平衡的重要機制，因此腫瘤細胞通過各種途徑逃逸凋亡成為了惡性腫瘤發生的重要機制之一［1］；而且也是腫瘤細胞耐藥的重要原因，這也就使細胞凋亡基因的研究成為了熱點。

第二個線粒體來源的胱氨酸酶激活劑（Smac，second mitochondria－derived activator of caspas－es），是由Wang實驗小組［2］和Verhagan實驗小組［3］在2000年先后從Hela細胞和293T細胞中分離出來一種蛋白質，定位于線粒體上，在細胞凋亡過程中有重要的作用［4］，其低表達可能抑制腫瘤細胞的凋亡。本實驗應用免疫組織化學法檢測Smac蛋白在正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織及卵巢上皮性癌中的表達，以期在卵巢癌的診斷、治療及預后中起到一定的指導意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取吉林大學中日聯誼醫院2008年1月－2009年10月間手術切除的組織標本，其中正常卵巢組織20例、卵巢良性上皮性腫瘤組織20例和卵巢上皮性癌組織60例。患者的病例病理資料完整，年齡在35－77歲之間，平均年齡45歲，所有患者術前都沒有進行放、化療和各種激素治療，也沒有合并其他任何系統的惡性腫瘤。卵巢上皮癌標本根據國際婦產科聯盟（FIGO，International Federation of Gynecology and Obstetrics）標準進行臨床分期和病理組織學分級。其中Ⅰ、Ⅱ期共30例，Ⅲ、Ⅳ期共30例，高分化組（G1）16例，中分化組（G2）12例，低分化組（G3）32例，按組織學分型漿液性囊腺癌25例，粘液性囊腺癌25例，子宮內膜樣癌10例。

1.2 方法

Smac兔抗人單克隆抗體（濃縮型）購于北京博奧森生物技術有限公司，Smac抗體工作濃度為1∶100。多聚HRP／AP免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物制品有限公司。具體操作按試劑盒說明書嚴格進行，以PBS代替一抗設立陰性空白對照。

1.3 結果判定

每張切片均在雙盲下進行判定，陽性表達為鏡下組織細胞結構清晰，在細胞胞漿內出現黃色或棕黃色顆粒，且染色明顯高于背景。根據免疫組化評分方法對陽性細胞著色強度記分，然后在高倍鏡下連續計數1000個細胞，對陽性細胞所占百分比進行評分，根據兩者結果進行分析，取兩者評分之乘積，結果＞3分為陽性，0－3分判為陰性。

1.4 統計方法

顯著性檢驗采用χ2檢驗，當T＜1或n＜40采用精確概率法，求P值。所有數據統計都在SPSS17.0軟件上進行。

2 結果

2.1 正常卵巢組織中、卵巢良性腫瘤組織、卵巢上皮癌中Smac蛋白的表達

Smac蛋白的陽性顆粒呈棕黃色，主要分布于細胞漿中，偶表達于胞核內，其在3組標本中均有表達，但從正常卵巢組織到卵巢良性上皮性腫瘤組織到卵巢上皮性癌組織中的表達率呈逐漸遞減的趨勢，依次為90.0%、85.0%，56.7%，卵巢上皮性癌組織中Smac的表達明顯低于正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織，存在顯著性差異，有統計學意義（χ2＝10.78，P＜0.05）。但是正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織中Smac的表達無明顯統計學差異（χ2＝0，P＞0.05），詳見表1。

2.2 Smac蛋白的陽性表達與卵巢上皮癌臨床病理特征的關系

表1 Smac蛋白在不同卵巢組織中的表達

Smac蛋白在卵巢上皮性癌高分化組中的陽性表達率為75.0%，中分化組的陽性表達率為75.0%，低分化組中表達率為40.6%，3組間比較，χ2＝7.19，P＜0.05，其表達存在明顯統計學差異。可見隨著組織病理分級的升高，Smac蛋白表達逐漸減弱。

在手術病理分期中Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ、Ⅳ期陽性表達率分別為70.0%、43.3%，二者相比，χ2＝4.34，P＜0.05，存在顯著性差異，有統計學意義。Smac蛋白的表達隨著手術病理分期的升高而逐漸減弱。

在卵巢上皮癌的組織學分型漿液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、子宮內膜樣癌中的表達率依次為56.0%、64.0%、40.0%，三者進行比較，χ2＝1.68，P＞0.05，差異不顯著，無明顯統計學意義，見表2。

表2 Smac蛋白的陽性表達與卵巢上皮癌臨床病理特征的關系

3 討論

Smac基因位于12號染色體長臂，由7個外顯子組成。成熟的Smac分子含有184個氨基酸，相對分子質量為21×103，等電點PI為5.3［5］。在Smac分子的氨基端有一段由丙氨酸、擷氨酸、脯氨酸和異亮氨酸組成的AVPI序列，又稱為凋亡抑制蛋白結合模體，是Smac行使功能所必須的。Smac促進細胞凋亡的機制：①在胞質內，Smac可以減弱或者去除IAP對caspase家族成員介導的蛋白酶級聯反應的抑制作用，而達到促凋亡的功能［6］。②caspase－3是受體介導和線粒體介導的凋亡途徑的共同的效應劑，而成熟的Smac蛋白不但能促進caspase－3前體的活化而且還可以增加已活化的caspase－3的活性［7－8］從而促進細胞凋亡。③Smac蛋白可以促進凋亡抑制蛋白的泛素化使其降解，從而減弱或消除其凋亡抑制作用。④還有研究表明Smac可以使腫瘤細胞出現G0／G1期停滯而發揮抗腫瘤作用［6］，但是具體機制有待于進一步研究。

相關文獻報道［9］在腫瘤組織中Smac蛋白呈低表達甚至缺失。Yoo［10］等人通過免疫組化分析，結果顯示：胃癌、結腸癌、橫紋肌肉瘤、肺癌、惡性皮膚纖維瘤、惡性神經鞘瘤、前列腺癌及平滑肌肉瘤中Smac蛋白的陽性表達率分別為70%（42／60）、70%（7／10）、45.5%（5／11）、40%（4／10）、28.6%（2／7）、25%（2／8）、20%（2／10）、16.7%（1／6），而在8例血管肉瘤及8例脂肪肉瘤中無表達。而本研究中，Smac蛋白在正常卵巢組織、卵巢良性上皮性腫瘤、卵巢上皮性癌中陽性表達率分別為：90%、85%、56.7%。由此推測Smac／DIABLO低表達可能抑制腫瘤細胞的凋亡。Sekimura等［11］在88個肺癌組織樣本中用逆轉錄PCR方法檢測Smac mRNA的表達，研究表明Smac mRNA低表達的病人預后差。Mizutani等［12］在78例新鮮腎細胞癌標本中用Western blot測定的Smac蛋白表達，發現Smac的表達與腎細胞癌的臨床分期和預后有顯著相關性。這與我們的研究結論是一致的，說明Smac的低表達可能預示著腫瘤更具有侵襲性和不良的預后，同時其在晚期（Ⅲ－Ⅳ期）卵巢上皮性癌中的表達低于早期（Ⅰ－Ⅱ期）卵巢癌的表達，這進一步說明了Smac低表達在卵巢上皮性癌的發生發展過程中起著重要作用。

卵巢癌患者對化療耐藥是導致患者生存率降低的一個重要原因。而在腫瘤中Smac的高表達可促進腫瘤細胞凋亡，并增加腫瘤細胞對化療的敏感性。鄭麗端［13］等研究表明在胃癌細胞中轉染外源性Smac基因，并使其呈過表達狀態，能提高MKN－45對化療藥物的敏感性。同樣有實驗表明［12］轉染Smac基因至腎癌組織中也能增加腎癌細胞對TRAIL／順鉑誘導凋亡的敏感性。McNeish等［14］將自行構建的Smac腺病毒載體轉染到卵巢癌細胞中，結果顯示卵巢癌細胞對化療和放療的敏感性均明顯增加。Jia［15］及Fulda［16］也用相關實驗證明了此結論。由此可見，如果在卵巢癌細胞中能增強Smac基因的表達，就有可能促使癌細胞加速凋亡，從而克服化療耐藥問題，當然，這仍然有待于我們進一步探究。科副教授、副主任醫師。

［1］劉俊華，吳紀祥，劉益飛，等.Livin在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義［J］.現代腫瘤醫學，2010，18（2）：247.

［2］DUC，FANG M，LI Y，et al.Smac，a mitochondrial protein that promotes Cytochrome－dependent caspase activati－on by elimination IAP inhibition［J］.Cell，2000，102（1）：33.

［3］VERHAGEN AM，EKERT PG，PAKUSCH M，et al.Identification of DIABLO，amammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins［J］.Cell，2000，102（1）：43.

［4］Hui KKW，Kanungo AK，Elia AJ，et al.Caspase－3deficiency reveals a physiologic role for Smac／DIABLO in regulation programmed cell death［J］.Cell Death Differ，2011，18（11）：1780.

［5］曠興林，羅云萍.促凋亡因子Smac／DIABLO的研究進展［J］.國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊，2003，24（4）：213.

［6］Shiozaki EN，Shi Y.Caspases，IAps and Smac／DIABLO：mechanisms from Structural biology［J］.Trends Biochem Sci.2004，29（9）：486.

［7］Chai J，Du C，Wu J，et al.Structural and biochemical basis of apoptotic activation by Smac／DIABLO［J］.Nature，2000，406（6798）：855.

［8］Wu G，Chai J，Suber TL，et al.Structural basis of IAP recognition by Smac／DIABLO［J］Nature，2000，408（6815）：1008.

［9］Kempkensteffen C，Hinz S，Christoph F.Expression levels of the mitochondrial IAP antagonists Smac／DIABLO and Omi／HtrA2 in clear－cell renal cell carcinomas and their prognostic value［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2008，134（5）：543.

［10］Yoo NJ，Kim SY，Kim HS，et al.Immunohistoch emical analysis of Smac expression in human carcinomas and sarcomas.APMIS，2003，111（3）：382.

［11］Sekimura A，Konishi A，Mizuno K，et al.Expression of Smac／DIABLO is a novel prognostic marker in lung cancer［J］.Oncol Rep，2004，11（4）：797.

［12］Mizutani Y，Nakanishi H，Yamamoto K，et al.Downregulation of Smac／DIABLO expression in renal cell carcinoma and its prognostic signify－cance［J］.J Clin Oncol，2005，23（3）：448.

［13］鄭麗端，童強松，陶凱雄，等.Smac基因過表達對胃癌細胞株MKN－45化療敏感性的影響［J］.癌癥，2004，23（4）：361.

［14］McNeish IA，Bell S，McKay T，et al.Expression of Smac／DIABLO in ovarian carcinoma cells induces apoptosis via a caspase292mediated pathway［J］.Exp Cell Res，2003，286（2）：186.

［15］Jia L，Patwari Y，Kelsey SM，et al.Role of Smac in human leukaemic cell apoptosis and proliferation［J］.Oncogene，2003，22（11）：1589.

［16］Fulda S，Wick W，Weller M，et al.Smac agonists sensitize for Apo2L／TRAIL or anticancer drug－induced apoptosis and induce regression of malignant glioma in vivo［J］.Nat Med.2002，8（8）：808.

Expression and clinical significance of Smac in epithelial ovarian carcinoma tissues

LIU Jun－bao，CAO Lu，LENG Wei－

chun.（Department of Obstetrics and Gynecology，China－Japan Union Hopsital，Jilin University，Changchun130033，China）

ObjectiveTo study the expression of Smac protein in normal ovarian tissues，benign ovarian tumor and epithelial ovarian carcinoma tissue and to clarify the relationship between Smac protein and clinical pathological features of epithelial ovarian carcinoma tissue.MethodsSurgical resection specimens in the China－Japan Union Hopsital of Jilin University from January 2008to October 2009were selected，including 20cases of normal ovarian tissue，20cases of benign ovarian epithelial tumors and 60cases of epithelial ovarian carcinoma.The expression of Smac protein were detected by immunohistochemical methed.Resultsthe expression of Smac protein in epithelial ovarian carcinoma tissues was significantly lower than in normal ovarian tissues and benign tumor tissues（P＜0.05）.The expression of Smac protein was gradually weakened with the increase of histopathological grades and surgical stage（P＜0.05），but there was no significant in different histological types（P＞0.05）.ConclusionThe low expression of Smac protein may contribute to the incidence and development of epithelial ovarian carcinoma，and its low expression may presage a more aggressive tumor and poor prognosis.

epithelial ovarian carcinoma；Smac protein；Immunohistochemical method

R737.31

A

2013－08－06）

劉俊寶（1974－），男，吉林大學中日聯誼醫院婦產

1007－4287（2014）10－1618－03

＊通訊作者