Clusterin在UUO大鼠模型中的表達及診斷意義

黃秀英，耿嘉男，劉 凱，陳艷芳，劉 暢，雷冬艷，于曉艷，孫 波＊

（1.吉林大學第一醫院，吉林長春130021；2.吉林大學藥學院，吉林長春130021）

Clusterin在UUO大鼠模型中的表達及診斷意義

黃秀英1，耿嘉男2，劉 凱2，陳艷芳2，劉 暢2，雷冬艷2，于曉艷2，孫 波2＊

（1.吉林大學第一醫院，吉林長春130021；2.吉林大學藥學院，吉林長春130021）

Clusterin被發現與許多腎臟損傷有關，在腎缺血再灌注損傷、有明顯排斥反應的腎移植患者以及一些藥物導致的急性腎損傷中Clusterin表達均有上調［1］，可作為腎損傷的分子生物標志物。單側輸尿管梗阻（uniliteral ureteral obstruction，UUO）能直接導致腎間質炎癥和纖維化等多樣性病理學改變，而Clusterin的表達與UUO造成早期腎損傷的關系尚未見詳細報道，本實驗擬通過大鼠單側輸尿管結扎建立急性腎損傷模型，探討Clusterin在早期腎損傷中的變化，觀察Clusterin在UUO大鼠腎組織中和尿液中表達情況，為早期腎損傷的無創臨床診斷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小鼠抗Clusterin單克隆抗體（R＆D公司），辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠二抗、通用型二步法免疫組化試劑盒（PV－6000）和DAB顯色劑（北京中杉生物技術有限公司）。

1.2 實驗動物及UUO模型建立

40只健康雄性Wister大鼠（210－230g，吉林大學實驗動物中心），適應性飼養1周，大鼠造模前禁食12小時后乙醚吸入麻醉，仰臥位固定。無菌條件下于左側中腹部切開皮膚，打開腹腔，在左后腹壁沿腎門向下辨認白色細線狀的輸尿管，游離左側輸尿管，分別在腎盂處和輸尿管上1／3處用手術線雙重結扎，在結扎線之間切斷輸尿管，逐層縫合腹壁皮膚。右側不結扎作為自身對照，假手術組僅游離輸尿管但不結扎［2］。分別于術后1、3和7d處死大鼠，取腎臟備用。

1.3 免疫組化檢測UUO大鼠腎臟Clusterin表達

UUO大鼠腎臟于10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，切片。切片經過脫蠟、水化，微波熱修復，冷卻后經3%H2O2滅活內源性過氧化酶，血清封閉后依次加入相應一抗和二抗后進行顯色。Clusterin一抗以1∶100稀釋后加入，滴加二抗以及染色步驟嚴格按照PV－6000說明書操作。在高倍鏡（×400）下，Clusterin以細胞質內出現黃色顆粒為陽性信號，每例切片隨機選5個腎小管－間質染色陽性視野，陽性細胞染色程度按0－3分計算：0分，正常；1分，淺黃色；3分，黃褐色；介于二者之間為2分。染色后同時觀察腎小管間質病理改變。

1.4 ELISA檢測UUO大鼠尿液Clusterin水平

大鼠于造模后第0d－7d每日收集尿液，假手術組為對照，尿液離心后取上清包被于96孔酶標板（按85μl包被液＋15μl樣品加入），4℃過夜；次日加入1%BSA 150μl／孔封閉1h后洗板3次×3 min；小鼠抗Clusterin單克隆抗體（以1∶1 000稀釋）100μl／孔，37℃1h后洗板；羊抗小鼠二抗（以1∶3 000稀釋）100μl／孔，37℃1h后洗板；鄰苯二胺－過氧化氫顯色系統顯色，置37℃避光顯色10 min后終止反應，經酶標儀檢測A490值。

1.5 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行分析，實驗數據以均數±標準差（ˉx±s）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05時視為有統計學意義。

2 結果

2.1 UUO大鼠腎臟病理學檢查

免疫組化結果顯示：假手術組大鼠腎臟無明顯病理改變，Clusterin蛋白無顯著表達，免疫組化評分為0分；造模1天的大鼠可觀察到腎小管擴張，偶見Clusterin有表達，評分為1分；造模3天后大鼠梗阻病變明顯，可見腎間質纖維化，腎小管嚴重損傷，且Clusterin表達明顯增多，評分為3分；4組（造模7天）大鼠梗阻病變相比3組有所減輕，纖維組織增加，Clusterin表達有所減少，評分為2分。見圖1。

2.2 各組UUO大鼠尿液中Clusterin表達

經檢測UUO造模成功第1－2d（0.54±0.16，0.63±0.20）尿液中Clusterin表達即開始升高，但與假手術組（0.49±0.18）相比無明顯統計學差異，表明大鼠造模后1－2d尿液中Clusterin即開始表達，UUO造模后第3－5d尿液中Clusterin（0.70± 0.21、0.81±0.29、0.78±0.27）均較假手術組尿液表達明顯升高，且具有統計學差異（P＜0.05），UUO造模后第6－7d尿液中Clusterin含量開始有所下降，但仍維持在較高水平（0.74±0.23、0.67± 0.21）。結果表明大鼠UUO造模成功后1－2d尿液中Clusterin即開始出現，第3－5d開始含量明顯增加，且達到高峰，第6－7d開始Clusterin含量趨于下降，但仍高于正常水平。

圖1 假手術組及模型組大鼠腎臟Clusterin表達（免疫組化，×200）

3 討論

單側輸尿管梗阻（uniliteral ureteral obstruction，UUO）模型是被廣泛應用的較好的腎小管間質纖維化模型，腎功能的惡化很大程度上取決于腎小管間質纖維化的程度，且腎小管間質纖維化通常是多種病因所致的慢性腎臟疾病進展甚至發展為終末期腎病的最后共同通路［3］。Clusterin是體內一種異二聚體糖蛋白，最初被發現于公羊睪丸液，在正常腎組織中很難檢測到，但在一些疾病導致的腎損傷時，Clusterin可見表達且參與疾病進程，如腎缺血再灌注損傷（IRI）發生時Clusterin即是一個保護細胞功能的分子伴侶蛋白［4］，有研究將腎小管上皮細胞做缺血再灌注誘導后第1d腎小管上皮細胞開始凋亡，且Clusterin開始表達，第3d時其表達至高峰，第7d時細胞功能基本恢復正常，但敲除Clusterin表達后腎小管上皮細胞凋亡的敏感性增強，提示Clusterin的表達缺乏可加重IRI損傷［5］。Marcella［6］等人采用2.5小時冷缺血的大鼠腎移植模型，研究發現在慢性腎移植腎病導致的腎損傷時炎癥細胞浸潤嚴重，腎間質纖維化明顯，腎小管嚴重擴張，同時Clusterin表達上調且呈時間依賴性，其相比KIM－1和NGAL等分子標志物具更高特異性和敏感性。

本實驗通過單側輸尿管結扎造成急性腎損傷模型，造模后梗阻側腎臟明顯腫大，腎皮質變薄，組織病理顯示腎間質淋巴單核細胞浸潤、腎小管擴張、間質水腫嚴重，隨造模時間的延長，腎小管產生囊性擴張、水腫程度減輕、纖維化病變加重，提示UUO造模成功。免疫組化檢測UUO大鼠腎臟Clusterin表達，結果表明：造模第1d時腎臟偶見Clusterin表達，第3d時表達最為明顯，第7d時Clusterin表達減少，但較假手術組比較腎損傷有所減輕。ELISA結果顯示第1dUUO大鼠尿液即有Clusterin表達，第3－5d尿液中Clusterin表達明顯增加且達到高峰，第6－7d開始尿液中其含量開始減少，但仍明顯高于正常水平。提示尿液Clusterin含量與其在UUO腎臟中含量及病變程度關聯性好，即UUO腎損傷早期尿液中Clusterin表達即有改變，提示尿液中Clusterin含量可作為UUO導致的腎損傷的生物標志物，且具較好的敏感性。本研究為系列研究，在前期研究中我們已證實尿液Clusterin含量與慶大霉素所致大鼠腎損傷病變程度關相關性好，本次又在UUO腎損傷模型中進行了驗證，為Clusterin盡早應用于臨床腎損傷的早期診斷提供了實驗依據。

［1］Zhou W，Guan Q，Kwan CCH，et al.Loss of clusterin expression worsens renal ischemia－reperfusion injury［J］.American Journal of Physiology－Renal Physiology，2010，298（3）：F568.

［2］薛 痕，樊均明，陳 亮，等.大鼠腎間質纖維化動物模型的實驗研究［J］.四川動物，2004，23（1）：16.

［3］Hodgkins KS，Schnaper HW.Tubulointerstitial injury and the progression of chronic kidney disease［J］.Pediatric Nephrology，2012，27（6）：901.

［4］Zhou W，Guan Q，Kwan CCH，et al.Loss of clusterin expression worsens renal ischemia－reperfusion injury［J］.American Journal of Physiology－Renal Physiology，2010，298（3）：F568.

［5］Nguan C Y，Guan Q，Gleave M E，et al.Promotion of cell proliferation by clusterin in the renal tissue repair phase after ischemiareperfusion injury［J］.American journal of physiology［J］，Renal physiology，2014，306（7）：F724.

［6］Franquesa M，Herrero E，Torras J，et al.Mesenchymal stem cell therapy prevents interstitial fibrosis and tubular atrophy in a rat kidney allograft model［J］.Stem cells and development，2012，21（17）：3125.

2013－11－20）

1007－4287（2014）10－1601－02

吉林省科技發展計劃資助項目（科技支撐計劃20120962）；吉林大學開放性創新實驗項目（2013B73337）

＊通訊作者

文章編號：1007－4287（2014）10－1603－04