抗原負載的樹突狀細胞對食管鱗癌細胞體外殺傷作用的實驗研究

趙 鑫，劉玉俠，常 穎，王啟文＊，盧衛平，王 寶，段北野

（1.吉林省腫瘤醫院，吉林長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林長春130012）

抗原負載的樹突狀細胞對食管鱗癌細胞體外殺傷作用的實驗研究

趙 鑫1，劉玉俠2，常 穎1，王啟文1＊，盧衛平1，王 寶1，段北野2

（1.吉林省腫瘤醫院，吉林長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林長春130012）

近年來，生物治療由于它抗腫瘤的獨特特點，在惡性腫瘤的治療中發揮著重要作用。樹突狀細胞（Dendritic Cells，DC）作為腫瘤生物治療中的一種，近年來研究的比較多，尤其在遞呈抗原抗腫瘤方面。本實驗通過抗原負載的DC對食道癌細胞體外殺傷作用進行研究。

1 材料和方法

1.1 材料淋巴細胞分離液（比重1.078）購于中國醫學科學院血研所科技公司；GM－CSF，TNF－α，IL－4購于Peprotech公司；IMDM培養基購于賽默飛世爾生物化學制品有限公司；胎牛血清購于北京元亨；MTT購于Sigma公司。Ecap－109細胞購于中國科學院上海生命科學研究所。

1.2 外周血單核細胞的分離用淋巴細胞分離液（比重1.078）分離人外周血單核細胞，然后將分離的外周血單核細胞用含10%FCS的IMDM培養液調細胞濃度為1×106／ml，放入細胞培養瓶中，進行培養。

1.3 樹突狀細胞的體外誘導、培養以上分離的單核細胞培養1天后，進行細菌污染檢測后，加入細胞因子GM－CSF100ng／ml，IL－4 50ng／ml，TNF－α10 ng／ml，37℃，5%CO2條件下在培養箱內培養，每3天半量換液并補加細胞因子，誘導DC生成。

1.4 Ecap－109細胞抗原的制備用含10%FCS的IMDM的培養液培養人食道鱗癌細胞Ecap－109至對數生長期，用0.25%胰酶消化后，放入恒溫水浴箱，43℃，2h進行熱休克，結束后用超聲細胞破碎儀破碎30min，15 000rpm，離心1h，取上清作為腫瘤抗原。

1.5 抗原濃度測定用紫外分光光度計測定提取抗原的OD值，用下列公式計算抗原濃度：抗原（蛋白）濃度（mg／ml）＝1.45×OD280－0.74× OD260。

1.6 腫瘤抗原負載DC將提取的腫瘤抗原（20 μg／ml）與培養6天的DC共同培養，3天后進行殺傷活性實驗。

1.7 抗原負載的DC及DC對Ecap－109細胞殺傷活性實驗

1.7.1 復蘇、培養Ecap－109細胞 將Ecap－109細胞從液氮中取出，復溫，洗滌后，用含10%胎牛血清的IMDM培養Ecap－109細胞至指數生長期，然后用0.25%胰酶消化，用IMDM培養液洗滌后，計數細胞數為5×104／ml，接種到96孔細胞培養板，每孔100μl。

1.7.2 將培養的DC、抗原負載的DC計數細胞數為1.25×106／ml，按以下設計加入到已經加入Ecap－109細胞并貼壁的96孔細胞培養板中，效應細胞（DC、抗原負載的DC細胞）與靶細胞（Ecap－109）的比例為25∶1，每組實驗設6復孔，培養48h。培養結束前4h加入MTT（5μg／ml），20μl／孔。培養結束后，吸去培養板中的上清，每孔加150μl DMSO，振蕩混勻，上酶標儀測OD值（492nm）。實驗分組：①DC對照；②DC＋Ag對照；③DC＋Ecap－109；④DC＋Ag＋Ecap－109；⑤Ecap－109對照。

1.8 殺傷活性計算公式100%。

1.9統計學處理應用SPSS V16.0軟件，采用t檢驗對數據進行分析處理。

2 結果

負載抗原的DC以及DC對人食道癌細胞株Ecap－109的殺傷作用，見表1。從表中抗原看出，負載抗原的DC對Ecap－109的殺傷作用明顯高于未負載抗原的DC（P＜0.01）。

表1 負載抗原的DC以及DC對人食道癌細胞株Ecap－109的殺傷作用

3 討論

食道鱗癌的治療以手術切除為主，輔以化療和放療，但其遠期療效仍不理想。ESCC患者就診時多已發展為晚期，手術難以完全切除，而放、化療不僅對造血系統、消化系統等產生嚴重毒性作用，最終還可能誘導腫瘤細胞產生免疫耐受。近年來腫瘤生物治療已經成為腫瘤治療的一種新手段，以DC疫苗活化CTL發揮抗腫瘤效應為基礎的免疫治療取得了初步成果［1－3］，這對食道鱗癌的治療具有深遠的意義。

生物治療的細胞有很多種，包括20世紀80年代初的LAK細胞，TIL細胞以及發展到現在的NK細胞，γδT細胞，T細胞，CIK細胞，DC細胞等，它們的作用原理相同，但是作用機制及效果不盡相同。樹突狀細胞（Dendritic Cells，DC）作為腫瘤生物治療中的一種，近年來研究的比較多，尤其在遞呈抗原抗腫瘤方面［4－6］，并且都得到了較好的實驗結果。本實驗通過抗原負載的DC對食道癌細胞體外殺傷作用的研究，尋找一種對食道鱗癌細胞有效的生物治療方法，為食道鱗狀細胞癌的治療提供一種新的治療手段。

DC是體內功能最強的抗原遞呈細胞，它能攝取、加工和遞呈腫瘤抗原，促使細胞毒T細胞（CTL）和T輔助細胞（Th）發揮抗腫瘤作用。

TIDC（tumor infiltrating dendritic cell）是浸潤至腫瘤及其附近轉移淋巴結內的樹突狀細胞，它的數量和功能可以反映機體的免疫狀態。研究發現［7］，食道癌組織中CD1α和CD83的表達低于正常黏膜組織，而CD1α是DC的特異標志，CD83是DC成熟的標志，說明食道癌組織DC的表達低于正常食道黏膜組織，轉移淋巴結的DC數目少于正常淋巴結，表明食道鱗癌患者機體全身或局部轉移淋巴結中免疫能力下降，也說明DC在抗腫瘤免疫中的重要作用。

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一個大的蛋白質家族，在細胞中起分子伴侶作用。近年來研究發現，這一家族除了具有重要的分子伴侶功能外，還參與細胞抗損傷、分化等作用，其中的HSP70在抗腫瘤免疫反應中發揮著重要作用。HSP70可以與抗原肽結合并能夠將與其結合的抗原多肽通過內源性途徑傳遞給MHC I類分子，引起特異性的T細胞活化，發揮抗腫瘤作用［8］。本實驗通過體外誘導DC生成，并用熱休克方法提取的熱休克蛋白70－抗原肽作為抗原，與DC共同培養，對食道鱗癌細胞Ecap－109進行體外殺傷實驗研究，證明無論是DC還是負載抗原的DC對Ecap－109均有較強的殺傷作用，其中負載抗原的DC對Ecap－109具有更強的殺傷作用（P＜0.01），證明從食道鱗癌細胞Ecap－109中提取的熱休克蛋白70抗原肽可以作為腫瘤抗原增強DC的抗腫瘤功能。

［1］楊靜悅，曹大勇，劉文超，等.L－18基因增強腫瘤抗原致敏DC誘導的CTL特異性殺傷肝癌細胞［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2009，16（1）55.

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［4］趙立波，李 才，周維國，等.樹突狀細胞負載的腫瘤抗原肽疫苗抗腦膠質瘤作用的實驗研究［J］.中國實驗診斷學，2009，13（1）：21.

［5］劉玉俠，于 鴻，張振武，等.熱休克蛋白70激發樹突狀細胞抗肝癌作用的實驗研究［J］.中國實驗診斷學，2010，14（12）：1969.

［6］盧衛平，賈春祎，王啟文，等.HSP70－抗原肽負載的DCs對肺癌細胞殺傷作用的實驗研究［J］.中國誤診學雜志，2011，11（24）：5807.

［7］王 雷，單保恩，劉 亮，等.食管鱗癌和轉移淋巴結組織中CD1α和CD83的表達及其臨床意義［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2009，16（4）：401.

［8］Nair SK，Synder D，Rous BT，et al.Regression of tumors in mice vaccinated with professional antigen－presenting cells pulsed with tumor extracts［J］.Int J Cancer，1997，70：706.

2013－09－28）

1007－4287（2014）10－1599－02

＊通訊作者