iASPP在壓力誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡中的表達及意義

王 英，楊海燕，許文晶，胡 萍，高志卓，徐韶琳＊

（1.吉林大學第二醫(yī)院眼科，吉林長春130041；2.吉化總醫(yī)院眼科）

iASPP在壓力誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡中的表達及意義

王 英1，楊海燕1，許文晶1，胡 萍1，高志卓2，徐韶琳1＊

（1.吉林大學第二醫(yī)院眼科，吉林長春130041；2.吉化總醫(yī)院眼科）

目的觀察P53凋亡刺激蛋白（ASPP家族的抑制因子iASPP）在壓力誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC－5）凋亡中的表達及意義。方法將視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC－5細胞）分別在60mmHg和80mmHg壓力條件下培養(yǎng)48小時，MTT方法檢測細胞活力，細胞染色檢測凋亡，RT－PCR，WESTERN－BLOT檢測P53和iASPP基因的變化。結果隨著壓力的增加RGC－5細胞活力下降，細胞凋亡逐漸增加，P53基因表達增加，iASPP基因的表達下降。結論在壓力誘導的RGC－5細胞凋亡中iASPP表達下降可能使P53活性增加，促進RGC－5細胞凋亡的發(fā)生，上調iASPP表達可能具有神經(jīng)保護作用。

P53凋亡刺激蛋白；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞；凋亡

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1589）

P53是調節(jié)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC）凋亡的重要蛋白。P53凋亡刺激蛋白家族的抑制因子（iASPP）為新近發(fā)現(xiàn)的一種重要P53抑制蛋白［1］。為探討iASPP在壓力誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC－5）凋亡中的作用，我們采用RT－PCR，WESTERN－BLOT方法檢測iASPP在壓力誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC－5）凋亡中表達水平并初步探討其意義，為青光眼視神經(jīng)保護治療新靶點的發(fā)現(xiàn)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）、胎牛血清（美國Hyclone公司）、兔抗鼠單克隆體P53（美國Santa公司），兔抗鼠多克隆抗體iASPP（美國Santa公司），PCR試劑盒（美國TaKa－Ra公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)RGC－5細胞培養(yǎng)應用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)于37℃，5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱。應用胰蛋白酶每3－4 d消化傳代1次。

1.3 MTT法檢測細胞增殖抑制率取對數(shù)期生長的RGC－5細胞，以8×103每孔密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，將RGC－5細胞分別在60mm－Hg，80mmHg壓力條件下培養(yǎng)48h，然后，每孔加入5mg／ml的MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h；吸除培養(yǎng)液；加入100μl DMSO終止反應，570nm波長測定吸光度（A），計算不同壓力對RGC－5細胞的增殖抑制率。

1.4 細胞染色檢測細胞凋亡Hoechst33342是一種可以穿透細胞膜的熒光染料，細胞毒性低。它在聚AT序列富集區(qū)與DNA結合，顯示凋亡細胞和活細胞。RGC－5細胞常規(guī)培養(yǎng)24h后，將RGC－5細胞分別在60mmHg，80mmHg壓力條件下培養(yǎng)48h，加入10mg／ml Hoe33342避光染色0.5h，然后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 半定量RT－PCR檢測RGC－5細胞常規(guī)培養(yǎng)24h后，將RGC－5細胞分別在60mmHg，80mm－Hg壓力條件下培養(yǎng)48h，取1×105個RGC－5細胞，利用Trizol一步法提取總RNA。利用隨機引物進行逆轉錄反應，得到cDNA。根據(jù)Genbank上的基因序列，利用引物設計軟件設計引物，內參GAPDH上游引物：5′－CATCAAGAAG GTGGTGAAGCAGG－3′；下游引物：5′－CCACCACCCTGTTGCT GTAGCCA－3′；擴增內參GADPH長度為206bp；iASPP上游引物：5′－GTGAAGGAGATGAACGACCCG－3′；下游引物：5′－AGTGCGACCCTTACCGCGAGG－3′，所擴增的iASPP目的片段長度為821bp。P53上游引物：5′－ACAGGACCCTGTCACCGAGGA－3′，下游引物5′－GACCTCCGTCACCGAGACC－3′，所擴增的P53片段長度303bp；以逆轉錄的cDNA為模板，用上述iASPP，P53引物和內參GADPH引物分別行PCR。反應體系為25μl（ddH2O 13μl；模板cDNA 5μl；10×Easy Taq Buffer 2.5μl；dNTP 2μl；上游引物1μl；下游引物1μl；Easy Taq DNA聚合酶0.5μl；Total 25μl）。反應條件為：95℃預變性5min，剩余34個循環(huán)95℃變性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s；最后72℃延伸5min，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)含花青素的1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并在紫外投射儀下進行觀察、拍照，并用凝膠成像系統(tǒng)進行分析。

1.6 Western BlotRGC－5細胞常規(guī)培養(yǎng)24h后，將RGC－5細胞分別在60mmHg，80mmHg壓力條件下培養(yǎng)48h，收集RGC－5細胞，應用細胞裂解液裂解細胞30min，于4℃，12 000r／min離心5min后取上清液，然后加上樣緩沖液并于沸水中煮5 min，以10%濃度的SDS－PAGE電泳分離。電泳完畢后，膠上的蛋白電轉移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h，加入一抗（1∶1 000）4℃過夜。TBST液漂洗30min，加入過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶2 000）室溫孵育30min，TBST液漂洗1 h，ECL染色。掃描獲得圖像。獨立實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學方法實驗所得數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件包完成。

2 結果

2.1 MTT方法檢測壓力對RGC－5細胞活力的影響MTT結果提示，隨著壓力的增加，RGC－5細胞的細胞活力下降，60mmHg壓力作用RGC－5細胞48h后使細胞活力下降17.7%，80mmHg壓力作用RGC－5細胞48h后使細胞活力下降23.4%，差異均有統(tǒng)計學意義。

2.2 細胞染色檢測細胞凋亡Hoe33342染色正常細胞的細胞核呈正常的藍色，而凋亡細胞的形態(tài)學常常發(fā)生改變，包括細胞皺縮，染色質濃染，顏色發(fā)白，核碎片、凋亡小體的形成。為了檢測壓力是否誘導RGC－5細胞凋亡，我們用Hoe33342對處理后的RGC－5細胞進行染色，結果顯示，壓力可以誘導RGC－5細胞發(fā)生染色質濃縮，凋亡小體形成，而且隨著壓力的增加，細胞凋亡現(xiàn)象更加明顯，見圖1。2.3 RT－PCR為檢測iASPP，P53在壓力誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC－5）凋亡中表達水平，我們在mRNA水平和蛋白水平對其進行檢測。結果顯示，60mmHg和80mmHg壓力作用RGC－5細胞48h后引起RGC－5細胞中iASPP的mRNA表達減少，P53的mRNA表達增加；蛋白表達水平與mRNA表達水平一致。綜上所述，壓力可以誘導RGC－5細胞發(fā)生凋亡，在凋亡過程中iASPP表達減少，P53表達增加，見圖2、3。

圖1 Hoe33342染色檢測RGC－5細胞在不同壓力下細胞凋亡變化

圖2 RT－PCR方法檢測RGC－5細胞在不同壓力下P53和iASPP的mRNA的表達

圖3 Western－blot方法檢測RGC－5細胞在不同壓力下P53和iASPP蛋白的表達

3 討論

青光眼是目前世界上主要不可逆性致盲眼病。青光眼導致視神經(jīng)萎縮的病理基礎是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡。在眾多調控細胞凋亡的因素中，P53與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡關系密切［2］。

p53凋亡刺激蛋白（apoptosis stimulating protein of p53，ASPP）是2001年發(fā)現(xiàn)的一個蛋白質家族［3］，該家族成員包括ASPP1、ASPP2和iASPP 3個成員。ASPP1和ASPP2通過提高原凋亡基因的活力促進p53依賴的細胞死亡。iASPP基因存在于從線蟲到人類等多種生物細胞內，序列高度保守［4，5］。iASPP與同一家族的ASPP1、ASPP2功能相反，它可以與ASPP1和ASPP2競爭結合p53的結合位點，通過特異性抑制p53的促細胞凋亡功能而抑制凋亡，而增加iASPP表達可以增強細胞的抗凋亡能力［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，通過反義RNA技術或RNA干擾技術使iASPP基因表達沉默后，可以增加秀麗隱桿線蟲發(fā)生p53依賴的細胞凋亡［1］。Ariel等［7］報道，增加iASPP的表達可以減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突損傷引起的凋亡。減少iASPP基因的表達可以增加促凋亡基因Bax，PUMA的表達，可以引起細胞凋亡或者增加細胞對促凋亡藥物的敏感性，進一步提示iASPP具有抗凋亡的作用［8－10］。總之，ASPP家族與P53結合形成ASPP－P53復合物，作用于原凋亡基因啟動子，ASPP的微小變化就可以引起P53結合DNA能力發(fā)生改變，從而影響p53誘導細胞凋亡的能力。

本研究結果顯示，壓力能誘導視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡。在正常培養(yǎng)的RGC－5細胞中，有P53和 iASPP基因的表達。隨著培養(yǎng)體系的壓力增加，P53表達呈上升趨勢，iASPP表達呈下降趨勢，P53和iASPP表達的動態(tài)變化，提示它們在壓力誘導的RGC－5凋亡中起重要作用，它們可能參與了RGC－5的凋亡進程，同時在壓力誘導的RGC－5凋亡中維持iASPP表達水平或使其表達上調可能具有神經(jīng)保護作用。但是目前我們還需要對iASPP功能進一步研究，才能揭示iASPP在整個細胞網(wǎng)絡中的作用。

［1］Bergamaschi D，Samuels Y，O’Neil NJ，et al.IASPP oncoprotein is a key inhibitor of p53conserved from worm to human［J］.Nat Genet，2003，33：162.

［2］Wilson AM，Morguette B，Abdouh M.ASPP1／2regulate P53－depedent death of retinal ganglion cells through PUMA and Fas／CD95activation in vivo［J］.J Neurosci，2013，33（5）：2205.

［3］Samuels－Lev Y，O’Connor DJ，Bergamaschi D，et al.ASPP proteins specifically stimulate the apoptotic function of p53［J］.Mol Cell，2001，8（4）：781.

［4］Ahn J，Byeon IJ，Byeon CH，et al.Insight into the structural basis of pro－and antiapoptotic p53modulation by ASPP proteins［J］.J Biol Chem，2009，284：13812.

［5］Bergamaschi D，Samuels Y，O’Neil NJ，et al.iASPP oncoprotein is a key inhibitor of p53conserved from worm to human［J］.Nat Genet，2003，33：162.

［6］Cao L，Huang Q，He J，et al.Elevated expression of iASPP correlates with poor prognosis and chemoresistant in FIGO lb－Ⅱa squamous cell cervical cancer［J］.Cell Tissue Res，2013，352（2）：361.

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［8］Liu ZJ，Cai Y，Hou L，et al.Effect of RNA interference of iASPP on the apoptosis in MCF－7breast cancer cells［J］.Cancer Invest，2008，26：878.

［9］Liu H，Wang M，Diao S，et al.siRNA－mediated down－regulation of iASPP promotes apoptosis induced by etoposide and daunorubicin in leukemia cells expressing wild－type p53［J］.Leuk Res，2009，33：1243.

［10］Yun Cai，Shi Qiu，Xing Gao，et al.iASPP inhibits p53－independent apoptosis by inhibiting transcriptional activity of p63／p73on promoters of proapoptotic genes［J］.Apoptosis，2012，17：777.

The expression and significance of iASPP gene in the apoptosis of retinal ganglion cells induced by pressure

WANG

Ying，YANG Hai－yan，XU Wen－jing，et al.（The second Hospital of Jinlin University，Changchun130041，China）

ObjectiveThis study was to explore the expression of iASPP on pressure—induced apoptosis of cultured retinal ganglion cells（RGC－5cells）.MethodsThe RGC－5cells were cultured under the pressure of 60mmHg and 80mmHg for 48hours.Cell viability were determined by MTT assays.Cells apoptosis was determined by Hoe33342.The expression of iASPP and P53was determined by using semi—quantitative RT—PCR and Western blot respective.ResultsMTT assay showed that the RGC－5cells viability was decreased in a pressure—dependent manner.As the pressure was up，the apoptosis of RGC－5cells was increased，the expression of P53was elevated and the expression of iASPP was decreased.ConclusionThe reduced expression of iASPP gene may increase the activity of p53and promote the apoptosis of RGC－5cells under pressure.Enhancing expression of iASPP may play a role as a neuroprotect.

iASPP；RGC；apoptosis

R775.1

A

2013－11－25）

1007－4287（2014）10－1589－03

吉林省科技廳資助項目（20090460）

＊通訊作者