A－NK細胞促口腔鱗狀細胞癌凋亡效應的研究

萬 哲，劉 紅，張 真，許 垚，郭也也，吳紫鶯，劉 映，祝 軍＊

（1.新疆醫科大學附屬中醫醫院口腔科，新疆烏魯木齊830000；2.中南大學湘雅醫學院臨床專業，湖南長沙410000）

A－NK細胞促口腔鱗狀細胞癌凋亡效應的研究

萬 哲1，劉 紅1，張 真1，許 垚2，郭也也2，吳紫鶯2，劉 映2，祝 軍1＊

（1.新疆醫科大學附屬中醫醫院口腔科，新疆烏魯木齊830000；2.中南大學湘雅醫學院臨床專業，湖南長沙410000）

目的通過觀察A－NK細胞對裸鼠舌鱗狀細胞癌移植瘤模型的體外生長特點以及口腔鱗狀細胞癌（OSCC）凋亡指數的檢測，探討A－NK細胞對OSCC的免疫治療機制。方法建立裸鼠舌鱗癌皮下移植瘤模型，隨機分為對照組、A－NK細胞組和NA－NK細胞組，觀察33天后瘤重，繪制腫瘤生長曲線；OSCC組織標本經末端脫氧核苷酸轉移酶介導的UTP缺口標記（TUNEL）染色以鑒定凋亡細胞，并由陽性細胞百分比表示細胞凋亡指數（AI）。結果ANK細胞組第15天開始腫瘤體積顯著小于對照組（P＜0.05）；NA－NK細胞組第27天后腫瘤體積顯著小于對照組（P＜0.05）；A－NK細胞組第30天腫瘤體積顯著小于NA－NK細胞組（P＜0.05），且三組荷瘤裸鼠腫瘤生長重量均有明顯差異，差異有統計學意義（P＜0.05）。NK組病例活檢癌組織AI為（0.71±0.66）%，A－NK組織AI為（1.76±0.83）%，二者間有顯著性差異（P＜0.01）；對照組癌組織AI為（0.34±0.69）%，與前二者間有顯著性差異（P＜0.01）。結論 A－NK細胞和NA－NK細胞均可在裸鼠體內誘導明顯的抗腫瘤效應，且A－NK的抑瘤作用大于NA－NK細胞。NK細胞對口腔鱗狀細胞癌具有免疫殺傷效應，該作用是通過誘導靶細胞凋亡實現的。

A－NK細胞；NA－NK細胞；舌鱗狀細胞癌；裸鼠移植瘤；抗腫瘤效應

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1582）

A－NK細胞被認為是一個表型和功能獨特的NK細胞亞群，具有高水平的NK細胞毒性和增殖能力，本課題旨在探索A－NK細胞在口腔鱗癌治療中的作用效果，為A－NK細胞的臨床應用提供動物實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

人舌鱗狀細胞癌細胞系Tca8113－Tb（上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院腫瘤生物實驗室），BALB／C－nu／nu裸小鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），磁珠分選儀（（德國美天旎生物技術有限公司）），淋巴細胞分離液（sigma公司），rhIL－2（南京軍區軍事醫學研究所），RPMI1640培養液（Gibco）。試劑蛋白酶K、辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素購自日本Wako公司，TdT Buffer、TdT、DTT、Biotin－16－dUTP、CoCl2購自瑞士Roche公司，dATP購自美國Phamacia Biotech公司，3，3’－diaminobenzydine（DAB）購自日本Dojin公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 NK細胞的分離純化 無菌抽取正常人群外周血，用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，經貼壁粘附和尼龍毛柱粘附去除單核細胞和B細胞。將上述分離去除單核細胞和B細胞后取得的單個核細胞（PBMC）溶紅素處理，平衡鹽充分洗滌后，加入到CD56單抗包被的磁珠系統中孵育，平衡鹽再次洗滌，于miniMACS分離器磁場中上柱分選，平衡鹽洗柱收集細胞。免疫磁珠儀檢測所得細胞表面CD3，CD56分子，分析NK細胞回收率和純化率。

1.2.2 A－NK和NA－NK細胞的分離 取免疫磁珠分選的高純度NK細胞，用a－MEM培養基調整細胞濃度為2×106／ml，置于無菌塑料平皿中，與6000U／ml IL－2水平培養3h（37℃5%CO2）。用溫a－MEM培養基洗脫收集非粘附的NA－NK細胞4次。加入PBS（含0.02w／vEDTA）4℃放置10min，冷a－MEM洗3次，收集粘附的A－NK細胞。

1.2.3 A－NK細胞和NA－NK細胞的體外擴增分別將收集的A－NK細胞和NA－NK細胞，用a－MEM培養基調整細胞濃度為2×106／ml，加入200 U／ml IL－2，培養于24孔板中。每3天更換新鮮培養液，補充細胞因子，保持細胞因子終濃度不變，細胞濃度在（3～4）×106／ml，并計數細胞，繪制出細胞生長曲線。

1.2.4 人舌鱗癌細胞皮下成瘤裸鼠模型的建立

取指數增殖期Tca8113細胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，調整細胞密度至1.0×107／ml，臺盼藍染色計數活細胞占95%以上。于每只裸鼠右前肢背部皮下接種2.0×106個（0.2ml）細胞，33天后處死，分離移植瘤，10%甲醛固定、脫水、石蠟包埋、制片（4μm厚），HE染色，光學顯微鏡下觀察。1.2.5 A－NK細胞免疫功能增強對口腔癌的效應

動物接種Tca8113細胞方法同人舌鱗癌細胞皮下成瘤裸鼠模型的建立。接種后第3天，將裸鼠隨機分為3組，每組7只，分別為對照組、NA－NK細胞組和A－NK細胞組。對照組每2天于接種腫瘤細胞的局部皮下注射0.1ml生理鹽水，NA－NK細胞組和A－NK細胞組每2天于接種腫瘤細胞的局部皮下分別注射相應細胞0.1ml（5.0×106）個，共注射3次。于接種腫瘤細胞2周后每3天用游標卡尺測量移植瘤的最小徑a、最大徑b，計算出移植瘤體積V＝a2b／2，并得出裸鼠移植瘤體積生長曲線。第33天斷頸處死小鼠，剝取移植瘤稱重。

1.2.6 A－NK細胞對口腔鱗狀細胞癌的凋亡誘導效應 ①TUNEL法具體操作按Roche試劑所附說明書進行。標記反應結束后，DAB顯色，蘇木精輕度復染，二甲苯透明，封片。②TUNEL結果評價方法，在200倍鏡頭下，每枚切片選擇5處不同視野，辨別凋亡細胞，發生凋亡的細胞其核呈棕黃色，在癌組織中散在分布。凋亡細胞數占腫瘤細胞總數的百分比確定為AI。

1.3 統計學處理

采用SPSS 18.0軟件系統的配對樣本t檢驗、χ2檢驗及Kaplan－Meier法Log Rank檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 分離A－NK細胞和NA－NK細胞

本研究采用免疫磁珠技術對NK細胞進行分離純化，計數細胞結果顯示：A－NK細胞數占41%，NA－NK細胞數占59%。

2.2 A－NK細胞的體外增殖能力

A－NK細胞在a－MEM培養基中生長良好，細胞透亮有光澤，貼附于器皿底部（見圖1），加入IL－2刺激因子后，A－NK細胞在第15天達到增殖高峰，NANK細胞于第12天達到增殖高峰。培養3周后，ANK細胞共增加39.33倍，NA－NK細胞僅增加16.33倍（見圖2）。

2.3 人舌鱗癌細胞皮下成瘤裸鼠模型的建立

剛接種舌鱗癌細胞的裸鼠均可見圓形小皮丘，第2天后消退，接種腫瘤細胞2周后，腫瘤開始緩慢生長，于18天后出現快速生長期。HE染色可見大量的舌鱗狀細胞癌細胞，細胞巢狀排列，呈多角型，核大，深染，部分腫瘤細胞蛻變壞死，并伴有淋巴細胞浸潤，提示建模成功（見圖3）。

圖1 A－NK細胞的體外培養（X20倍）

圖2 A－NK細胞與NA－NK細胞生長曲線比較

圖3 舌鱗癌細胞的HE染色（X200）

2.4 A－NK細胞對裸鼠移植瘤的抑制作用

A－NK細胞組第15天開始腫瘤顯著小于對照組，各時間點均P＜0.05；NA－NK細胞組第27天后腫瘤顯著小于對照組，P＜0.05；A－NK細胞組第30天腫瘤顯著小于NA－NK細胞組，P＜0.05。實驗結果提示局部應用A－NK細胞和NA－NK細胞對裸鼠口腔鱗癌移植瘤均有明顯的抑制作用，但ANK細胞組對腫瘤的抑制作用強于NA－NK細胞組（見圖4）。

2.5 三組裸鼠的瘤重比較

第33天，A－NK細胞組腫瘤重量顯著較對照組輕，P＜0.05；NA－NK細胞組腫瘤重量顯著較對照組輕，P＜0.05；A－NK細胞組腫瘤重量顯著較NA－NK細胞組輕，P＜0.05（見表1）。見圖5。

表1 第33天各組裸鼠移植瘤重量（均數±標準差）

2.6 NK細胞對口腔鱗狀細胞癌的凋亡誘導作用

NK組病例活檢癌組織AI為（0.71±0.66）%，A－NK組織AI為（1.76±0.83）%，二者間有顯著性差異（P＜0.01）；對照組癌組織AI為（0.34± 0.69）%，與前二者間有顯著性差異（P＜0.01）。

圖4 裸鼠移植瘤體積生長曲線

圖5 三組裸鼠的腫瘤標本

3 討論

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）是由上皮組織惡變而來的口腔惡性腫瘤，約占口腔頜面部惡性腫瘤的80%以上，發病率高。盡管口腔鱗癌的治療水平不斷提高，經過以手術、放療和化療為主的綜合序列治療后5年生存率已達到64%左右，但仍有多于1／3的患者5年內死于腫瘤的局部復發和（或）遠處轉移，嚴重危害人類健康。因此，進一步闡明影響口腔鱗癌發生、發展和預后的分子機制，設計新型診斷方法和有效治療藥物，對于提高口腔鱗癌患者的生存率和生存質量具有十分重要的現實意義。

A－NK細胞（Adherent natural killer）是近年發現的表型和功能獨特的NK細胞亞群，具有高水平的NK細胞毒性和增殖能力，能識別“自己”和“非己”，對自身細胞無殺傷作用，在體外和體內實驗中均表現出強大的抗腫瘤和抗轉移作用。但其在人體血液中數量較少，需體外擴增以達到臨床級別的細胞數量［1，2］。體外培養NK細胞主要分為兩個過程：貼壁和生長，細胞黏附至培養介質上，進而鋪展，這是貼壁細胞生長的必要條件。須玨華等［3］對兔骨髓間充質干細胞在DMEM－HG，DMEM－LG，a－MEM三種培養基中貼壁效果進行實驗研究，發現a－MEM有利于細胞貼附，本研究中采用a－MEM培養基，A－NK和NA－NK細胞貼服于培養基底，生長狀態良好。A－NK細胞具有強大的體外擴增能力，有研究報道在IL－2參與下96hA－NK細胞增殖比NA－NK細胞快［4］，本研究中A－NK細胞和NA－NK細胞培養3周后，A－NK細胞共增加39.33倍，NANK細胞僅增加16.33倍，提示A－NK細胞的增殖能力強于NA－NK細胞，也證實了這一實驗研究。

良好的動物模型是研究腫瘤治療干預途徑的前提條件，SCID（Severe Combined Immune－deficiency）小鼠即嚴重免疫缺陷小鼠，是一種先天性B與T淋巴細胞雙重免疫缺陷動物，可成為腫瘤免疫治療的良好活體承載系統。但普通SCID小鼠有滲漏（Leaky）現象，約有2%－3%的子代具有少量的淋巴樣細胞，且可產生少量免疫球蛋白。本研究選用的是SCID／BG小鼠，它是BALB／c－beige／beige同源近交系小鼠將beige基因引入C.B－17SCID小鼠體內，其體內NK細胞活性降低，且滲漏現象大幅降低，優于普通的SCID小鼠。

本研究中，A－NK細胞組第15天開始腫瘤顯著小于對照組，NA－NK細胞組第27天后腫瘤顯著小于對照組，可以證明局部應用A－NK細胞與NA－NK細胞均有顯著抑瘤作用。A－NK細胞組第30天腫瘤顯著小于NA－NK細胞組，提示A－NK細胞的抑瘤作用顯著強于NA－NK細胞。

本研究中發現，NK細胞可以有效的誘導口腔鱗狀細胞癌的瘤細胞凋亡，從而發揮抑制腫瘤的作用，而其中A－NK細胞的凋亡誘導作用明顯強于NK細胞。因此，NK細胞系對于口腔鱗狀細胞癌具有有效地免疫抑制作用。可能通過多種機制抑制腫瘤細胞：（1）通過穿孔素和顆粒酶介導途徑，二者的協同作用可使A－NK細胞產生最佳效應的細胞毒作用；（2）直接接觸腫瘤細胞發揮殺傷作用，NK細胞表達的TNF死亡配體可與腫瘤表面的死亡受體相結合發揮殺傷效應。（3）細胞因子介導途徑，A－NK細胞分泌多種細胞因子，通過破壞腫瘤微循環或改變靶細胞表面的pH值，糖代謝等方式殺死腫瘤細胞。（4）ADCC介導途徑［5］。本實驗中發現腫瘤細胞凋亡與壞死同時存在，推斷可能是多種機制共同作用的結果。

本研究提示A－NK細胞能有效抑制裸鼠舌鱗癌移植瘤的生長，但目前國內外對其研究還停留在基礎實驗階段，其具體作用機制尚不明確，因此ANK細胞直接用于臨床受多方面因素制約，尚需對A－NK細胞免疫功能重建進行更斷深入探索研究，為臨床應用提供合理依據。

［1］Chang DT，Colton E，Matsuda T，et al.Lymphocyte adhesion and interactions with biomaterial adherent macrophages and foreign body giant cells［J］.J Biomed Mater Res A，2009，91（4）：1210.

［2］Wei J，Satomi M，Negishi Y，et al.Effect of sera on the adhesion of natural killer cells to the endothelium in severe pre－eclampsia［J］.J Obstet Gynaecol Res，2006，32（5）：443.

［3］須玨華，胡靜波，周 燕，等.培養基對兔骨髓問充質干細胞擴增與分化的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（3）：467.

［4］藍毓濱，藍毓進，藍毓新.A－NK細胞聯IL－2，IL－12在腫瘤免疫治療中的作用［J］.生物磁學，2006，6（1）：79.

［5］ChanCJ，Smyth MJ，Martinet L.Molecular mechanisms of natural killer cell activation in response to cellular stress［J］.Cell death and differentiation，2013，21（1）：5.

The experimental research of A－NK Cells and NA－NKcells on Tumor Growth Inhibition of Humantongue squamous cell car－cinoma

WAN Zhe，LIU Hong，ZHANG Zhen，et al.（Department of Stomatology，Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital，Xin jiang Medical University，Urumqi 830000，China）

ObjectiveBy observing the external growth and hyperplasia of A－NK cell，To explore the treatment effect and mechanism of A－NK on the subcutaneous transplanted tumor of tongue squamous cell carcinoma in nude mice.And provide the experimental foundation in clinical use of such treatment strategies for tongue squamous carcinoma.MethodsThe subcutaneous nude mice model with Tca8113cells was established and randomly assigned to three groups.Every group had 7nude mice.The control Group injected with normal saline，The experimental group injected with A－NK cells and NA－NKcells，All animals were killed after 33days，The tumor volumes and weight in each group were measured and to draw the curve of tumor growth.ResultsThe Volume of nude mice tumor in A－NK group is smaller than the control group after 15days（P＜0.05）；The Volume of nude mice tumor in NA－NK group is smaller than the control Group after 27days（P＜0.05）；and the Volume of nude mice tumor in A－NK group is smaller than theNA－NK Group after 30days（P＜0.05），There were significant differences among the three groups in terms of the weight of nude mice tumor（P＜0.05）.ConclusionA－NK cells and NA－NK cells can significantly inhibit the subcutaneous transplanted tumors of nude mice and the A－NK group is stronger than the NA－NK group.

A－NK cells；NA－NK cells；Tongue squamous cell carcinoma；Nude mice model；Anti－tumor effect

R739.81

A

2013－09－11）

1007－4287（2014）10－1582－04

新疆維吾爾自治區科技支疆項目（201191158）

＊通訊作者