新霉素對腦膠質瘤細胞增殖及PDGF、VEGF和血管生成素表達的影響

趙 佳，郝利銘，姜文華，孔德霞，李洪成，周 莉

（吉林大學基礎醫學院組織學與胚胎學系，吉林長春130021）

新霉素對腦膠質瘤細胞增殖及PDGF、VEGF和血管生成素表達的影響

趙 佳＊，郝利銘，姜文華，孔德霞，李洪成，周 莉

（吉林大學基礎醫學院組織學與胚胎學系，吉林長春130021）

目的探討新霉素對腦膠質瘤細胞增殖及PDGF、VEGF和血管生成素表達的影響。方法采用人腦膠質瘤細胞U251，DMEM培養基添加10%胎牛血清培養。MTT細胞活性實驗檢測細胞增殖，Real Time PCR檢測mRNA表達情況，酶聯免疫吸附實驗檢測蛋白表達。結果MTT結果表明，新霉素對U251細胞增殖存在抑制作用，并以劑量依賴的方式進行，并發現新霉素的抑制作用隨時間增強。Real Time PCR結果顯示，新霉素作用后U251細胞中PDGF、VEGF和血管生成素mRNA的表達都受到不同程度的抑制，分別降低了26.75%、38.23%和43.87%。ELISA分析表明新霉素能夠降低PDGF、VEGF和血管生成素蛋白水平的表達。結論新霉素能夠抑制腦膠質瘤細胞U251中PDGF、VEGF和血管生成素的表達并抑制腦膠質瘤細胞增殖。

新霉素；腦膠質瘤；PDGF；VEGF；血管生成素

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1579）

腦膠質瘤是顱內最常見的原發性腦腫瘤，其富含血管，是高度血管依賴性的惡性腫瘤，血管新生化程度與其惡性程度、生物侵襲性、臨床復發和預后均密切相關［1］。最近研究發現，新霉素在血管發生過程中具有抑制作用。新霉素可抑制血管生成素在內皮細胞中發生核轉移，進而抑制血管發生和細胞增殖，并且新霉素對前列腺癌的生長和血管發生具有抑制作用［2－3］。腫瘤血管發生受多種血管生成因子的調節，本文中，我們研究了新霉素對腦膠質瘤細胞增殖的作用，并進一步分析新霉素對三種重要的血管發生因子：PDGF、VEGF和血管生成素表達的影響，探討新霉素抑制腦膠質瘤的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人腦膠質瘤細胞U251購自上海細胞研究所細胞庫。DMEM培養基購自GIBCO，胎牛血清購自TBD公司，MTT購自Sigma公司，ELISA檢測試劑盒購自R＆D公司。

1.2 細胞培養

人腦膠質瘤細胞U251采用DMEM培養基，添加10%胎牛血清培養。置于37℃、5%CO2孵箱中，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 MTT細胞活性檢測實驗

收集對數期細胞，以6×103cells／孔的密度接種于96孔板，培養24h后，加入不同濃度新霉素溶液以及對照生理鹽水，繼續培養0、12、24、48、72h。吸去上清，向每孔加入100μl MTT工作溶液（0.5 mg／ml），繼續培養4h。小心吸去上清，加入100μlDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解，在酶標儀492nm處測量各孔的吸光值。細胞增殖抑制率＝（對照組A值－干擾組A值）／對照組A值×100%。

1.4 細胞總RNA的提取

采用Trizol法提取細胞總RNA（Invitrogen Corporation，Grand Island，New York，USA）。每組細胞沉淀中加入1ml Tizol，吹打均勻，靜止5 min。加入200μl氯仿，劇烈振蕩混勻1min，靜置3 min；4℃下12 000r／min離心10min；將上清液小心轉移到DEPC處理的1.5ml EP管里，加入500 μl異丙醇，混勻，室溫放置10min；4℃下15 000r／min離心10min；棄上清，75%乙醇（約1ml）洗2次，4℃，12 000rpm，離心5min；棄上清，室溫干燥（5－10min）；用30μl Rnase－free水溶解RNA，于分光光度計上測定RNA濃度及純度，分裝，－80℃保存備用［4］。

1.5 反轉錄

取1μg總RNA，按照Reverse Transcription System（Promega，Madison，USA）說明書進行操作。將反轉錄得到的cDNA片段用DEPC水稀釋5倍，分裝，－80℃保存備用。

1.6 Real Time PCR

反應體系為：12.5μl SYBR Green Realtime PCR Master Mix，Sense引物（2μM）2.5μl，Antisense引物（10μM）2.5μl，模板2μl，dH2O（滅菌蒸餾水）5.5μl。

反應條件為：95℃預變性10min，95℃30s，52℃60s，72℃30s，擴增40個循環。反應在熒光定量PCR儀（Stratagene，Mx3000P，USA）上進行。

每份標本設3個復孔檢測，取其循環閾值均值（Ct值，即PCR反應過程中出現熒光信號的初始循環數）。以管家基因β－actin為內參，采用比較2－△△Ct法分析各基因在細胞中的相對含量。

PCR反應中用到的引物：

β－actin引物：

Sense：5’－TCGTGCGTGACATTAAGGAG－3’

Antisense：5’－ATGCCAGGGTACATGGTGGT－3’PDGF引物：

Sense：5′－CTGCTCATCATATTCCAACCC－3′

Antisense：5′－CCTACCACAgTCTCCCTCCT－3′

VEGF引物：Sense：5’－GCCGTCCAATCGAGACCCT－3’Antisense：5’－CATGGCGATGTTGAACTCCTC－3’

Angiogenin引物：

Sense：5’－CATCATGAGGAGACGGGG－3’

Antisense：5’－TCCAAGTGGACAGGTAAGCC－3’。

1.7 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）

收集細胞上清液，采用雙抗體夾心法分別檢測PDGF、VEGF和血管生成素的表達情況。嚴格按照ELISA Kits說明書進行操作。使用全自動酶標儀（Multiskan MK3，Finland）進行吸光值檢測。

2 結果

2.1 新霉素抑制腦膠質瘤細胞增殖

采用MTT法檢測新霉素對腦膠質瘤細胞增殖的影響，結果如圖1所示。MTT結果表明，作用48 h后，隨著新霉素濃度的增加，U251細胞的增殖率逐漸下降（圖1A），新霉素濃度為100μM時，U251細胞的增殖減少了12.27%。而400μM時，細胞的增殖減少了58.38%。說明新霉素對U251細胞增殖存在抑制作用，并以劑量依賴的方式進行。同時我們檢測了不同時間新霉素對U251細胞增殖的作用情況，發現新霉素的抑制作用隨時間增強，如圖1B。

2.2 新霉素抑制腦膠質瘤細胞中PDGF、VEGF和血管生成素的表達

首先我們從mRNA水平上檢測新霉素對PDGF、VEGF和血管生成素表達的影響。收集U251細胞，提取細胞總RNA，進行反轉錄，以反轉錄后的cDNA為模板進行Real Time PCR。結果如圖2，與對照組細胞相比，新霉素作用后U251細胞中PDGF、VEGF和血管生成素mRNA的表達都受到不同程度的抑制，分別降低了26.75%、38.23%和43.87%。

為進一步驗證新霉素對3種蛋白表達的影響，我們進行了ELISA分析。收集細胞上清液，采用雙抗體夾心法分別檢測3種蛋白的表達情況，結果如表1、圖2。從圖中可以看出，新霉素作用后，降低了PDGF、VEGF和血管生成素蛋白水平的表達，抑制率分別為29.77%、46.38%和42.48%。

表1 各組膠質瘤細胞中PDGF、VEGF和血管生成素蛋白的表達（pg／ml）

圖1 MTT檢測新霉素對U251細胞增殖的影響

圖2 Real Time PCR檢測新霉素對PDGF、VEGF和血管生成素mRNA表達的影響

3 討論

腦腫瘤是中年男性與癌癥有關的死亡中第三位最常見的死因，其起源一般為星形細胞、室管膜細胞、少枝膠質細胞和混合來源。膠質瘤是最常見的原發性腦腫瘤，占所有病例的60%［5］。目前盡管采用手術、放療和化療等多種手段，但對腦膠質瘤的治療仍很有限。近年來研究發現，血管生成因子與腫瘤的發生發展密切相關，血管為腫瘤提供營養物質并排出代謝產物，腫瘤通過新生血管發生轉移；血管生成因子也能夠直接促進腫瘤細胞的增殖［6－7］。

我們的實驗證實新霉素抑制腦膠質瘤細胞增殖，并且新霉素能夠抑制腦膠質瘤細胞中PDGF、VEGF和血管生成素的表達。PDGF、VEGF和血管生成素是3種重要的血管發生因子，在腦膠質瘤中均高表達，并在腦膠質瘤的發生發展過程中發揮重要作用［8－10］。提示新霉素可能是通過抑制這3種因子的表達，從而抑制了腫瘤細胞的生長。

新霉素是氨基糖苷類抗生素的一種，它能夠與原核生物核糖體的小亞單位結合，從而導致mRNA錯讀，繼而抑制翻譯過程，所以它對許多有機體都具有殺菌作用［2］。而新霉素與其結構類似的化合物如基因菌素（G418）最大的區別在于，新霉素對于大多數的真核細胞沒有毒性，因為其不與真核生物的核糖體結合［3］。

有報道表明新霉素能夠抑制血管生成素、aFGF、bFGF等在內皮細胞中發生核轉移，進而抑制它們誘發的血管發生，并且新霉素對基礎水平和自發的內皮細胞增殖沒有顯著的抑制作用，但能夠顯著抑制由血管生成素、aFGF、bFGF等誘發的內皮細胞增殖［3］，這說明新霉素比非特異性的細胞生長抑制劑具有更好的針對性和高效性。本實驗結果表明，隨著新霉素濃度的增加，U251細胞的增殖率逐漸下降，新霉素對腦膠質瘤的抑制作用存在劑量依賴。100μM新霉素使細胞增殖減少了12.27%。而400μM時，細胞增殖減少了58.38%。

目前新霉素的毒性情況是已知的，當新霉素過量使用時，會引發腎和第八神經損傷［11］。在臨床上使用新霉素治療細菌感染，口服劑量為4－8g／天，肌內注射劑量為1－2g／天。本實驗中新霉素抑制U251細胞增殖的IC50值為375μM，這一濃度低于已報道的其在細胞培養物中引起毒性所需的濃度（～1mM）［12］。

綜上，新霉素能夠抑制腦膠質瘤細胞中PDGF、VEGF和血管生成素的表達并制腦膠質瘤細胞增殖，而三種因子為重要的血管發生因子，所以理論上新霉素不但可以抑制腦膠質瘤生長所必需的新血管發生，又對腦膠質瘤細胞的增殖具有直接的抑制作用，那么新霉素作為抗腫瘤藥物將會比單純抑制腫瘤血管發生或細胞增殖的抑制劑更有效。

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Effect of neomycin on cell proliferation and expression of PDGF，VEGF，angiogenin in glioma cells

ZHAO Jia，HAO Li－

ming，JIANG Wen－hua，et al.（Department of Histology and Embryology，College of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun130021，China）

ObjectiveTo observe the effect of neomycin on cell proliferation and expression of PDGF，VEGF，angiogenin in U251glioma cells.MethodsThe cell proliferation was analyzed using MTT.Real Time PCR and ELISA were applied to investigate the expression of PDGF，VEGF，angiogenin.ResultsThe MTT results showed that neomycin positively inhibited the cell proliferation of U251cells and the inhibition was enhanced by dose－dependent and time－dependent.Real Time PCR and ELISA results showed that neomycin inhibited the expression of PDGF，VEGF，angiogenin both on mRNA level and protein level.ConclusionNeomycin positively inhibited the cell proliferation and expression of PDGF，VEGF，angiogenin in U251glioma cells.

neomycin；glioma；PDGF；VEGF；angiogenin

R730.264

A

趙佳，31歲，女，博士，講師，主要從事腫瘤細胞生物學研究。

2013－06－06）

1007－4287（2014）10－1579－04

＊通訊作者