ChAT表達激活劑的篩選及其機制研究

董明勤，劉 飆，劉 燕，李文剛，李中秋

（1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林長春130033；2.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院）

ChAT表達激活劑的篩選及其機制研究

董明勤1，劉 飆1，劉 燕1，李文剛1，李中秋2＊

（1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林長春130033；2.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院）

目的利用ChAT啟動子熒光素酶報告系統對中藥小分子化合物進行篩選，以期找到能夠促進ChAT表達的化合物。方法用構建的ChAT啟動子熒光素酶報告體系從400余種中藥小分子化合物中篩選ChAT啟動子激活劑，并用RT－PCR和Western Blot方法對篩選得到的小分子化合物進行驗證。利用免疫印跡法分析篩選得到的化合物對細胞內信號通路的影響。結果通過篩選發現大豆甙元能夠激活ChAT啟動子的活性，與對照相比具有顯著性差異（P＜0.05）。進一步研究結果顯示，大豆甙元也可以促進ChAT mRNA和蛋白的表達。另外，大豆甙元能夠促進細胞內ERK的磷酸化，并進而激活ERK／MAPK信號通路。結論大豆甙元能夠促進ChAT基因的表達，并引起細胞內ERK／MAPK信號通路的改變。

大豆甙元；藥物篩選；ChAT；神經干細胞；ERK／MAPK信號通路

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1576）

乙酰膽堿（ACh）已被證明在中樞神經系統（CNS）調節著不同的生理功能，包括認知、注意力和覺醒等，在中樞神經系統中膽堿能神經元的機能失調也與年齡相關的記憶障礙、神經系統退行性疾病阿爾茨海默病（AD）的發病相關［1］。乙酰膽堿轉移酶（ChAT）是膽堿能神經元遞質乙酰膽堿合成的限速酶［2］。早期的觀點認為，中樞神經系統無法進行自我更新和修復是因為中樞神經系統內不存在干細胞。直到Randon等學者提出神經干細胞的概念，他們從小鼠海馬區域分離出可以增殖、分裂，并具有多項潛能的神經干細胞［3］。目前，神經干細胞的定向誘導分化研究已經成為生命科學領域中最引人注目的熱點。隨著神經干細胞研究的迅速發展，神經干細胞定向誘導分化和移植治療神經損傷及退行性疾病也逐漸成為可能。那么，在體內外研究定向分化的機制、尋找治療靶點、開發新的治療藥物，已成為現代醫學和生物學研究的重點問題。鑒于ChAT是膽堿能神經的重要標志物，本研究以ChAT啟動子為靶點，對小分子化合物庫進行篩選，以期發現能夠促進ChAT基因表達的小分子化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DMEM購自GIBCO公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；Trizol購自Invitrogen公司；DEPC購自Sigma公司；逆轉錄及PCR試劑盒購自北京全式金公司；熒光素購自BD Monolight TM公司，ONPG購自上海生物工程公司；ERK1／2和p－ERK1／2的抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；ChAT抗體購自Millipore公司；抗GAPDH抗體購自上海康成生物有限公司。

1.1.2 細胞與質粒 人胚胎腎細胞293T（HEK293T）及小鼠畸胎瘤細胞（P19）購自上海細胞研究所細胞庫并由實驗室傳代培養。ChAT啟動子熒光素酶報告質粒為本實驗室構建。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養 將P19細胞用含10%胎牛血清、100μg／ml鏈霉素、100μg／ml青霉素的DMEM培養基進行培養，置于37℃，5%CO2培養箱中。細胞傳代時，用DMEM或D－Hanks緩沖液清洗細胞以除去培養基和血清，隨后用0.25%的胰蛋白酶溶液（含有0.2%EDTA）消化細胞，在倒置顯微鏡下觀察，當細胞形態發生變化時，用移液器將胰蛋白酶溶液小心地吸出，再加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，將細胞吹打至完全脫落，并按照一定比例進行傳代。

1.2.2 細胞轉染與熒光素酶活性檢測 轉染前一天將P19細胞以1×105／孔的比例接種到24孔細胞板中，使細胞在轉染前長到80%左右；次日將ChAT啟動子熒光素酶報告載體轉染入P19細胞（步驟參見Invitrogen的LipofectamineTM2000）中，轉染時為了減少誤差，同時將pCMV－β－gal質粒共同轉染。48h后取出細胞，棄去舊的培養基，每孔中加入100μl細胞裂解液，置于冰上30min。在96孔白板中加入5μl的Assay cocktail，再加入45μl細胞裂解液及100μl檢測液，立即用熒光化學發光儀測定熒光素酶的活性；另取出20μl細胞裂解液置于酶標板中，加入β－半乳糖苷酶（β－gal）活性檢測液50μl至液體變黃，通過酶標儀測定OD450值，并用此值來標化熒光素酶活性值，從而修正由于轉染效率的差異而引起的誤差。

1.2.3 化合物的篩選 利用ChAT啟動子熒光素酶報告體系對本實驗室中藥庫中400多種中藥單體及中藥有效組分進行初步篩選。用ChAT啟動子熒光素酶報告載體轉染細胞24h后，加入中藥化合物（化合物終濃度為5μg／ml）繼續培養8－12h后進行熒光素酶活性檢測。

1.2.4 RNA提取與RT－PCR 將待提取RNA的細胞取出，用TRIzol法提取RNA（步驟參見Invitrogen產品說明），逆轉錄后進行PCR擴增（步驟參見北京全式金公司產品），將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。RT－PCR引物見表1。

1.2.5 蛋白質提取與Western Blot 將大豆甙元（終濃度為5μg／ml）處理24h的細胞取出，提取蛋白、SDS－PAGE電泳分離后轉膜2h、封閉后用TBST漂洗，加入稀釋相應濃度的第一抗體，4℃孵育過夜后多次漂洗，標記第二抗體。孵育1h后漂洗，顯影分析。

表1 RT－PCR引物

2 結果

2.1 ChAT基因轉錄激活劑的篩選

用以ChAT啟動子為靶點的篩選模型對400余種小分子化合物進行篩選，通過檢測ChAT啟動子驅動的熒光素酶的活性來判斷化合物對ChAT啟動子活性的影響。結果如圖1所示，大豆甙元（daidzein）對ChAT啟動子具有明顯的激活作用，與對照相比在統計學上具有顯著性差異（＊P＜0.05）。

圖1 Daidzein對ChAT啟動子活性的影響

2.2 Daidzein對ChAT mRNA和蛋白表達的影響

鑒于Daidzein具有激活ChAT啟動子的作用。我們進一步通過RT－PCR和免疫印跡法檢測了Daidzein對ChAT mRNA和蛋白表達的影響。結果如圖2及3所示，Daidzein同樣可以促進ChAT－mRNA和蛋白的表達。

圖2 Daidzein對ChAT mRNA表達的影響

圖3 Daidzein對ChAT蛋白表達的影響

2.3 Daidzein對細胞內信號通路的影響

為了研究Daidzein對細胞內的信號通路的影響，我們通過Western blot方法檢測了Daidzein對ERK／MAPK信號通路的影響。結果如圖4所示，Daidzein可促進ERK1／2的磷酸化，說明Daidzein可激活ERK／MAPK信號通路，提示Daidzein促進ChAT基因的表達可能與其激活ERK／MAPK信號有關。

圖4 Western blot檢測Daidzein對ERK／MAPK信號的影響

3 討論

膽堿能神經元在中樞神經系統中發揮至關重要的作用，參與學習、記憶、睡眠等生理功能。中樞神經系統中膽堿能神經元的機能失調也與年齡相關的記憶障礙、神經系統退行性疾病阿爾茨海默病（AD）的發病相關［4］。自從Randon等分離出神經干細胞之后，神經再生的研究成為了生命科學領域的研究熱點［1］。也使神經干細胞的移植及定向誘導分化成為可能。有學者研究發現，激活素和bFGF能夠誘導神經干細胞定向分化為ChAT陽性細胞和TH陽性細胞［5］。但是激活素和bFGF均為細胞因子，成本較高，且容易失活，因此尋找更加低廉、穩定的神經分化誘導劑仍是生命科學領域的重點問題。鑒于ChAT是膽堿能神經的重要標志物，本研究以ChAT啟動子為靶點建立篩選模型，對中藥小分子化合物庫中的化合物進行篩選，以期發現能夠誘導干細胞向膽堿能神經進行分化的中藥化合物。結果發現，Daidzein對ChAT基因的轉錄具有促進作用，此作用進一步通過RT－PCR和免疫印跡得到證實。

本研究應用的啟動子水平篩選模型從基因表達調控出發，針對某一特定的靶點進行藥物篩選，有更好的專一性、效率更高、篩選范圍更廣，避免了以往動物水平篩選和組織水平篩選的劣勢。但是這僅僅是初步的研究，如何從細胞，分子水平的篩選過度到臨床試驗，還有很長的路要走［6］。

ERK／MAPK是與細胞增殖密切相關的通路，可通過促進某些基因表達，影響細胞的增殖及分化［7］。ERK是ras絲裂原信號轉導途徑下游的核心元件，ERK被激活后可進入核內，促進多種轉錄因子磷酸化，如ERK促進血清反應因子（SRF）磷酸化，并結合含有血清反應元件（SRE）的靶基因啟動子，調節其轉錄活性［9］。本研究通過Western blot分析發現，中藥化合物大豆甙元能夠促進ERK的磷酸化，進而激活ERK／MAPK信號通路。提示Daidzein促進ChAT基因的表達可能與其激活ERK／MAPK信號有關，但尚需要進一步的實驗去證明。本研究為進一步研制和開發膽堿能神經分化誘導劑奠定了實驗基礎。

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Screening of ChAT gene expression modulators from Small－molecule Compounds and study of the modulation mechanisms

DONG Ming－qin，LIU Biao，LIU Yan，et al.（China Japan Union Hospital of Jilin University，Changchun130033，China）

ObjectiveScreening of ChAT gene expression activator from traditional Chinese medicine compounds library.MethodsScreening of ChAT gene expression activator from over 400compounds by using ChAT gene promoter driven luciferase reporter system，then investigated the compound effect on the expression of ChAT mRNA and pretein by RT－PCR and western blot.The effect of compounds on intracellular signaling pathway was study by western blot.ResultsDaidzein was found that can promote the activity of ChAT promoter（P＜0.05），and further increase the ChAT expression in both mRNA and protein levels.In addition，Daidzein can promote ERK1／2phosphorylation and activite the ERK／MAPK signaling pathway.ConclusionDaidzein can promote the expression of ChAT gene，and activite the ERK／MAPK signaling pathway.

Daidzein；compound screening；ChAT；neural stem cells；ERK／MAPK signaling pathway

Q786

A

2014－01－11）

1007－4287（2014）10－1576－03

＊通訊作者