抑制IGFBP－2基因的表達對U251細胞增殖和凋亡的影響

許淑芬，王英凱，馬寅芙，劉 磊，孫牧男，方艷秋，譚 巖＊

（1.吉林省人民醫院中心實驗室，吉林長春130021；2.吉林大學第一醫院胃腸內科，吉林長春130021）

抑制IGFBP－2基因的表達對U251細胞增殖和凋亡的影響

許淑芬1，王英凱2，馬寅芙1，劉 磊1，孫牧男1，方艷秋1，譚 巖1＊

（1.吉林省人民醫院中心實驗室，吉林長春130021；2.吉林大學第一醫院胃腸內科，吉林長春130021）

目的探討RNA干擾技術沉默胰島素生長因子結合蛋白2（IGFBP－2）對膠質瘤細胞株U251增殖、凋亡的影響，為膠質瘤的基因治療提供一個可選擇的靶點和方法。方法構建靶向IGFBP－2基因的RNAi表達載體；采用脂質體法將siRNA轉染U251細胞，設非特異的siRNA陰性對照組和未轉染siRNA的陰性對照組；采用RT－PCR法半定量檢測siRNA對IGFBP－2基因表達的抑制作用；用MTT法測定U251細胞增殖變化；流式細胞術檢測siRNA誘導細胞凋亡作用。結果構建的RNAi表達載體抑制了IGFBP－2基因的表達（P＜0.01）；RNA干擾沉默IGFBP－2基因可抑制U251細胞增殖，促進細胞凋亡。結論在細胞水平上，構建的靶向IGFBP－2的siRNA可明顯抑制IGFBP－2基因的表達，導致膠質瘤細胞凋亡率明顯上升（P＜0.01），為進一步利用RNA干擾進行膠質瘤的基因治療研究奠定基礎。

RNA干擾；膠質瘤；胰島素生長因子結合蛋白2；增殖；凋亡

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1572）

膠質瘤是顱內常見惡性腫瘤，占顱內腫瘤的35%－60%。具有惡性度高、易復發、預后差等臨床特點。膠質瘤呈浸潤性生長，手術無法全切，需結合放療、化療、生物治療等綜合治療手段以延長患者生存期。近年來，國內外隨著人們對膠質瘤發生和發展研究的不斷深入，基因治療作為一種新型的腫瘤治療方法越來越受到人們的重視，且成為膠質瘤研究的熱點。胰島素樣生長因子結合蛋白－2（Insulinlike growth factor binding protein－2，IGFBP－2）是胰島素樣生長因子（Insulin－like growth factor， IGF）系統的成員之一，IGFBP－2主要在胎兒增生能力旺盛的組織中表達，出生后表達明顯下降。近幾年研究顯示，IGFBP－2在許多腫瘤中表達明顯升高，如膠質瘤［1，2］、前列腺癌［3］、卵巢癌［4］、結腸癌［5］、乳腺癌［6］。并且隨腫瘤級別增加IGFBP－2的表達增高，IGFBP－2在腫瘤惡性進展中起重要作用［2］。由此提示IGFBP－2可能作為腫瘤的診斷治療靶點。本研究依據RNA干擾原理［7］，以IGFBP－2基因為靶點，IGFBP－2高表達的U251膠質瘤細胞為研究對象，構建靶向IGFBP－2基因的RNAi表達載體，用lipofectamin 2000轉染U251細胞，研究其特異抑制IGFBP－2基因表達、抑制U251細胞增殖、誘導膠質瘤細胞凋亡的能力。

1 材料與方法

1.1 主要材料膠質瘤U251細胞株、大腸桿菌DH5α、pSilencer2.1－U6neo載體本室保存；Trizol Reagent為Invitrogen公司產品；AMV Reverse transcriptase、Oligo（dT）15primers及RNasin Ribonuclease Inhibitor為Promega公司產品；Taq DNA–polymerase、T4DNA ligase、限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ、DNA Marker均為Takara公司產品；annexin V－FITC／PI凋亡試劑盒購于百奧生物；引物由賽百盛公司合成。

1.2 IGFBP－2siRNA、IGFBP－2、β－actin引物的設計與合成根據GenBank中報道的IGFBP－2的核苷酸序列（NM－000597），參考siRNA及引物的設計原則，利用Ambion公司siRNA在線設計軟件。從IGFBP－2核苷酸序列起始密碼子下游尋找符合設計特征的靶序列，篩選得到908－926nt 19bp片段為靶序列（siRNA的篩選另報道），設計的siRNA序列5’端和3’端分別引入BamHⅠ、HindⅢ兩個酶切位點，加入9bp的loop環結構，3’末端加轉錄終止信號TTTTTT。同時采用國際通用的與所有基因均無同源性的序列siRNA為陰性對照見表1。經BlastSearch檢索確認與IGFBP－2以外的人類已知基因序列無同源性。

基于這些關系表的頻繁挖掘方法可以采用直接連接的方法，形成一張大表。但是這種方法會導致性能低下、統計偏斜等問題。故本文利用關系數據庫的特點對傳統方法進行改進。算法主要包括如下4個步驟。

表1 針對IGFBP－2基因設計的寡核苷酸序列

1.3 重組質粒的構建和轉染合成的兩條互補siRNA鏈在退火緩沖液作用下退火，用T4連接酶連接于經雙酶切（HindⅢ、BamH I）的質粒pSilencer2.1－U6neo中，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α，隨機挑取菌落。接種于LB培養基中，振蕩過夜，質粒提取試劑盒提取質粒鑒定。取對數生長期的U251細胞接種于6孔板，密度達80%時，用lipofectamin 2000轉染重組質粒，轉染6h以后更換含20%FBS培養液繼續培養48h。G418篩選，收集G418抗性細胞。實驗分為U251細胞對照組，U251轉染空質粒的陰性對照組，轉染pSilencer2.1－U6 neo非特異質粒的siRNA對照組，轉染pSilencer 2.1－U6neo－IGFBP質粒的目的siRNA實驗組。

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1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡實驗操作按照annexin V－FITC／PI凋亡試劑盒說明書進行，將培養后細胞用PBS洗3次，加入annexin V－FITC／PI 20μl，室溫下避光孵育15min，上流式細胞儀進行分析。

2.1 RT－PCR檢測IGFBP－2 mRNA表達轉染pSilencer 2.1－IGFBP的U251細胞與3個對照組相比IGFBP－2mRNA表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。而3個對照組（無關siRNA對照組、空載體對照組和U251細胞對照組）細胞中都存在較高水平的IGFBP－2mRNA表達，相互比較無統計學差異（P＞0.05）。見表2、圖1。

因此，在膨潤土MEL計算涉及的“三率”項中，選礦回采率高是普遍容易實現的，因此，選礦回收率權重值控制在30～35為宜，其中采用部分選礦的取30，不選的取35，膨潤土資源稟賦可直接加工。

1.4 RT－PCR檢測IGFBP－2 mRNA表達使用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，參照Invitrogen公司說明操作，使用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄為cDNA，選擇β－actin作為內參照。PCR循環參數為：95℃預變性5min，然后95℃45s、55℃45s、72℃45 s，30個循環后再72℃延伸10min。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統掃描電泳結果。

2.2 MTT法檢測轉染siRNA后U251細胞增殖的變化U251細胞增殖水平顯示，IGFBP－2RNAi組細胞在24h、48h、72h各時間點A值均明顯低于相應時間點的各對照組（P＜0.01），各對照組各時間點A值比較無統計學意義（P＞0.05），結果見表3。

2 結果

1.5 MTT檢測細胞增殖變化取各組對數生長期細胞，用胰酶消化收集，調整單細胞懸液密度為2× 106·ml－1個。按每孔200μl（2×103個細胞）接種于96孔培養板內。置37℃5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。從第24h開始，每隔24h隨機取1塊96孔板，每孔加入5g·L－1MTT液20μl，繼續培養4 h后，吸出孔內培養液，每孔加入150μl DMSO。將培養板置于微孔板振蕩器上振蕩10min，使結晶物溶解。酶標儀檢測各孔A值，檢測波長為490nm，增殖抑制率＝（1－試驗組A值／實驗組A值）× 100%。

表2 IGFBP－2 mRNA相對表達量（n＝3，x—±s）

圖1 RT－PCR檢測IGFBP－2 mRNA表達

1.7 統計學處理實驗數據采用SPSS 11.5統計學軟件進行分析.計量資料以平均值±標準差（x—± s）表示，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2.水進去約數十秒后就會到達全身每個角落，可以促進細胞的新陳代謝，讓身體從睡眠中醒過來，有提神醒腦的功效；

表3 RNAi后不同時間各組U251細胞增殖力的變化（n＝3，x—±s）

2.3 轉染siRNA后U251細胞凋亡率的變化轉染后48h，實驗組細胞凋亡率較各對照組明顯升高（P＜0.01），各對照之間比較（P＞0.05）差異無統計學意義，見圖2。

圖2 流式細胞術檢測U251細胞凋亡率

3 討論

膠質瘤是最常見的原發性顱內腫瘤。膠質瘤目前首選手術治療，術后多采用放療、化療等綜合治療，但治愈率仍不理想，平均生存期約50周，因此如何提高膠質瘤的早期診斷率，以及有效地促進膠質瘤細胞凋亡都是人們積極研究的方向；IGFBP－2同屬胰島素樣生長因子系統（insulin－like system，ICFs），是一類具有促有絲分裂活性的、參與組織生長和分化的生長因子家族，通過與1型和2型IGF受體（IGFR）相互作用，在不同的組織中刺激細胞增殖和抑制凋亡，從而與一些惡性腫瘤的發生有關［8］。Sallinen等［9］通過cDNA微陣列及組織芯片技術發現，高度惡性的膠質母細胞瘤（GBM）中IGFBP－2高表達，其表達越高，預后越差。Elmlinger等［10］發現，大量表達IGFBP－2的細胞常聚集于腫瘤壞死灶附近，IGFBP－2與GBM形成和進展密切相關。Muller［11］發現，中樞神經系統腫瘤病人腦脊液IGFBP－2顯著升高。許多研究發現IGFBP－2血漿水平可預測高級別膠質瘤的臨床結局［12，13］。且隨著IGFBP－2水平增高預后不良［14，15］。因此提示IGFBP－2可能作為膠質瘤的治療靶點，通過降低IGFBP－2水平，抑制膠質瘤細胞的生長，促進其凋亡。

本研究設計了能夠在細胞內表達靶向IGFBP－2基因的siRNA的質粒并將其導人U251細胞。實驗結果表明，RNAi質粒載體的導入明顯抑制了IGFBP－2mRNA的表達。空質粒組與空白對照組的結果差異無顯著性，排除了質粒本身對基因的抑制作用。陰性對照組與空白對照組的結果差異亦無顯著性，說明了RNAi的高度特異性。構建的IGFBP－2RNAi載體轉染U251細胞后，MTT和流式細胞儀檢測結果顯示U251細胞的增殖率明顯降低，而凋亡比例顯著升高。本實驗初步證實了以IGFBP－2為目的基因，通過RNAi技術可特異性地抑制其在人膠質瘤U251細胞中的過度表達，并抑制U251細胞增殖及誘導其細胞凋亡，為未來腦膠質瘤的基因治療打下了基礎。本研究只觀察了沉默IGFBP－2基因后U251細胞增殖率降低、凋亡比例升高，其機理及臨床可行性等有待進一步研究。

［1］Fuller GN，Rhee CH，Hess KR.Reactivation of insulin－like growth factor binding protein 2expression in glioblastoma multiforme：a revelation by parallel gene expression profiling［J］.Cancer Res，1999，59：4228.

［2］Elmlinger MW，Deininger MH，Schuett BS，et al.In vivo expression of insulin－like growth factor－binding protein－2in human gliomas increases with the tumor grade［J］.Endocrinology，2001，142（4）：1652.

［3］Cohen P，Peehl DM，Stamey TA，et al.Elevated levels of insulinlike growth factor－binding protein－2in the serum of prostate cancer patients［J］.J Clin Endocrinol Metab，1993，76（4）：1031.

［4］Lancaster JM，Sayer RA，Blanchette C，et al.High expression of insulin－like growth factor binding protein－2messenger RNA in epithelial ovarian cancers produces elevated preoperative serum levels［J］.Int J Gynecol Cancer，2006，16（4）：1529.

［5］Mishra L，Bass B，Ooi BS，et al.Role of insulin－like growth factor－I（IGF－I）receptor，IGF－I，and IGF binding protein－2in human colorectal cancers［J］.Growth Horm IGF Res，1998，8（6）：473.

［6］Busund LT，Richardsen E，Busund R，et al.Significant expression of IGFBP2in breast cancer compared with benign lesions.［J］.J Clin Pathol，2005，58（4）：361.

［7］Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double－stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391（6669）：806.

［8］Chen JC，Shao ZM，Sheikh MS，et a1.Insulin－like growth factorbinding protein enhancement of insulin like growth factor－I（IGF－I）mediated DNA synthesis and IGF－I binding in a human breast carcinoma cell line.［J］.J Cell Physiol，1994，158：69.

［9］Sallinen SL，Sallinen PK，Haapasalo HK，et a1.Identification of differentially expressed genes in human gliomas by DNA microarray and tissue chip techniques［J］.Cancer Res，2000，60（23）：6617.

［10］Elmlinger MW，Deininger MH，Schuett BS，et a1.In vivo expression of insulin－like growth factor－binding protein－2in human gliomas increases with the tumor grade［J］.Endocrinology，2001，142（4）：1652.

［11］Muller HL，Oh Y，Lehrnbecher T，et a1.Insulin－like growth factor－binding protein—2concentrations in cerebrospinal fluid and serum of children with malignant solid tumors or acute leukemia［J］.J Clin Endocrinol Metab，1994，79（2）：428.

［12］Lin Y，Jiang T，Zhou K，et al.Plasma IGFBP－2levels predict clinical outcomes of patients with high－grade gliomas［J］.Neuro Oncol，2009，11（5）：468.

［13］李方成，戴學元，陶宗玉，等.胰島素樣生長因子結合蛋白－2在腦膠質瘤中的表達及意義［J］.中華實驗外科雜志，2004，21（5）：594.

［14］Yang P，Yan W，Zhang W，et al.Whole－genome messenger RNA profiling reveals genes involved in malignant progression of glioma［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2013，93（1）：5.

［15］Han S，Meng L，Han S，et al.Plasma IGFBP－2levels after postoperative combined radiotherapy and chemotherapy predict prognosis in elderly glioblastoma patients［J］.PLoS One，2014，9（4）：e93791.

Effects of RNA interference silencing IGFBP－2 gene on proliferation and apoptosis of human glioma U251 cells

XU Shu－fen，WANG Ying－kai，MA Yin－fu，et al.（Central Laboratory，Jilin Province People’s Hospital，Changchun130021，China）

ObjectiveTo investigate the effect of silencing IGFBP－2with RNA interference on the proliferation and apoptosis of the glioma U251cells，and to provide a viable method for the gene therapy of glioma.MethodsRNAi expression vector for IFGBP－2was constructed and transfected to U251cell with lipofectamin.RT－PCR method was used to detect the variation of IGFBP－2mRNA level.MTT method was used to measure the variation in the proliferation of U251cells.Flow cytometer was used to monitor cell apoptosis and changes.Results The construction of RNAi expression vector inhibited the expression of IGFBP－2mRNA；Silencing IGFBP－2gene with RNA interference could inhibit the proliferation of U251cells and induce the apoptosis of U251cells（P＜0.01）.ConclusionRNAi technique can effectively inhibit the expression of IGFBP－2gene（P＜0.01），hence inhibit the proliferation of U251cells and induce the apoptosis of U251cells.

RNA interference；glioma；IGFBP－2；Proliferation；Apoptosis

R730.264

A

許淑芬（1963－），女，吉林省長春市人，主任技師，主要從事免疫與分子生物學實驗技術的研究。

2013－11－26）

1007－4287（2014）10－1572－04

吉林省科技廳項目資助課題，編號（201015220）

＊通訊作者