大鼠退變髓核腰交感神經干注射對交感神經干炎癥因子表達的影響

卞晶晶，唐元章，武百山，范 婷，倪家驤＊

（1.清華大學玉泉醫院麻醉科，北京100049；2.首都醫科大學宣武醫院疼痛科，北京100053）

大鼠退變髓核腰交感神經干注射對交感神經干炎癥因子表達的影響

卞晶晶1，唐元章2，武百山2，范 婷1，倪家驤2＊

（1.清華大學玉泉醫院麻醉科，北京100049；2.首都醫科大學宣武醫院疼痛科，北京100053）

目的觀察X線引導下大鼠退變髓核腰交感干注射對腰交感神經干炎癥因子表達的影響。方法實驗用雄性SD大鼠共72只，隨機分為三組：空白對照組、假手術組、髓核注射組。髓核注射組大鼠行X線下自體退變髓核懸液右側腰交感干注射，假手術組注射等劑量生理鹽水，空白對照組不做任何處理。注射后14天，取各組大鼠右側腰交感干行組織學觀察，并采用ELISA法定量分析炎性細胞因子IL－1β、IL－6和TNF－α表達變化。結果髓核注射組大鼠腰交感干組織學觀察發現有明顯的炎性細胞浸潤及血管腫脹、充血；ELISA檢測發現腰交感干IL－1β（20.1± 4.40pg／ml），IL－6（26.5±8.9pg／ml）及TNF－α（60.77±6.37pg／ml）蛋白含量比空白對照組IL－1β（8.02±1.31pg／ml），IL－6（10.30±1.43pg／ml），TNF－α（24.38±4.81pg／ml）及假手術組IL－1β（7.52±2.11pg／ml），IL－6（11.58± 2.56pg／ml），TNF－α（26.12±6.81pg／ml）表達顯著增高（P＜0.05）。結論大鼠自體退變髓核導致腰交感神經干炎癥因子表達升高可能與盤源性內臟痛的發生有關。

炎癥因子；交感干；炎性反應；髓核；大鼠

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1567）

腰椎間盤突出癥是臨床的常見疾病，目前研究認為椎間盤后突出引起腰腿痛的主要原因是髓核外漏導致的脊神經根無菌性炎癥［1－3］。腰椎間盤前突出在臨床上并不少見［4］。由于腰交感神經干緊鄰腰椎前方分布，因此，腰椎間盤前突出導致的無菌性炎癥在理論上會刺激腰交感神經干產生交感神經相關癥狀；雖然交感神經的疼痛傳導通路已經被證實［5，6］，但是椎間盤前突與腰交感神經相關癥狀之間的關系在臨床尚未被引起重視。本實驗擬采用改良的X線引導下大鼠椎間盤退變模型，通過腰交感神經干周圍注射大鼠退變髓核懸液，采用腰交感干組織學觀察及ELISA法進行細胞因子檢測觀察大鼠退變髓核懸液對交感神經的致炎作用，以期揭示椎間盤前突導致交感神經炎性病變的產生，為臨床上“椎間盤源性內臟痛”的發病機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

ELISA試劑盒（IL－1β，IL－6，及TNF－α）購于美國R＆D公司。造影劑（omnipaque－180dye）購于通用電氣藥業（上海）有限公司。

1.2 實驗動物及分組

實驗動物為雄性SD大鼠，8－10周，體重250－300g，由北京維通利華實驗動物中心提供。所有實驗動物適應環境3天后進入實驗。所有的實驗動物單籠飼養，72只大鼠隨機分為空白對照組（n＝24）、假手術組（n＝24）和髓核注射組（n＝24）。

1.3 動物模型制作

假手術組及髓核注射組動物建立大鼠退變髓核模型。大鼠退變髓核模型的建立參考Zhang等報道的方法［7］，并改進為X線引導下穿刺，提高模型成功率及穿刺準確程度，減少損傷。具體方法為：在X線引導下，將21號穿刺針平行于尾椎終板，穿刺至Co4／5到Co8／9椎間盤中心。數秒之后，穿刺針拔出，局部壓迫止血。

大鼠退變髓核模型建立2周之后，髓核注射組大鼠苯巴比妥鈉麻醉后斷尾，3－0絲線縫合斷尾處。取尾椎Co4／5到Co8／9椎間盤髓核，見髓核呈膠凍樣，將5個髓核混勻于0.5ml生理鹽水。斷尾縫合之后的大鼠至于X線下，取俯臥位，采用21號穿刺針（3.8cm長）在X線引導下穿刺與L2／3椎體右前外側，正、側位透視確定穿刺針位置，穿刺針穿刺到位后，緩慢注射0.5ml造影劑（omnipaque－180 dye），顯示造影劑沿椎體前外側上下擴散呈線性，證實穿刺到位。穿刺位置確定后10min，緩慢注射之前準備的0.5ml髓核混懸液于腰交感干周圍。注射完畢后，緩慢退針，穿刺點局部壓迫止血。假手術組行斷尾術，腰交感干周圍同樣方法注射0.5ml生理鹽水。空白對照組不行任何處理。

1.4 腰交感干組織學觀察

腰交感干切片行HE（Hematoxylin and eosin）染色觀察組織形態學變化。腰交感干注射后14天，每組大鼠隨機取6只，苯巴比妥鈉麻醉后行右側L（Lumber）1－5交感干取出術。取出腰交感干標本先用10%甲醛液固定1天，再在0.003MEDTA，1.35NHCl溶液中脫鈣24小時，石蠟固定，冠狀切片（5μm），HE染色，鏡下觀察腰交感干組織學變化。

1.5 ELISA檢測腰交感干細胞因子IL－1β，IL－6，及TNF－α蛋白含量

腰交感干注射后14天，采用ELISA檢測方法定量分析大鼠右側L1－5腰交感干IL－1β，IL－6，及TNF－α蛋白含量。因為大鼠單個腰交感干樣本太小，定量分析數值太小很難測定，因此我們將每組中剩余18只大鼠隨機每三只腰交感干合為一組，因此合并為6個檢驗樣本。樣本稱重勻漿后，嚴格按照ELISA試劑盒操作順序進行蛋白測定，蛋白濃度單位pg／ml。

1.6 統計學分析

采用SPSS17.0軟件進行統計分析。ELISA檢測數據以均數加減標準差（x—±s）表示，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 腰交感干組織學觀察

大鼠腰交感干注射后14天，髓核注射組大鼠腰交感干切片HE染色可見明顯的神經髓鞘內血管腫脹充血、炎性細胞浸潤，提示腰交感干炎癥反應的發生；空白對照組和假手術組腰交感干切片HE染色未見有明顯的炎癥反應（圖1）。

圖1 大鼠右側L1－5腰交感干組織學觀察鏡下所見。石蠟切片空白對照組（A），假手術組（B）和髓核注射組（C）。髓核注射組可見明顯的交感干炎癥反應發生。直箭頭：炎性細胞，燕尾箭頭：血管腫脹和充血。HE×400

2.2 ELISA方法檢測腰交感干IL－1β，IL－6，及TNF－α蛋白含量

腰交感注射后14天收集大鼠右側L1－5腰交感干采用ELISA法定量分析IL－1β，IL－6，及TNF－α蛋白含量。髓核注射組IL－1β（20.1±4.40pg／ml），IL－6（26.5±8.9pg／ml）及TNF－α（60.77±6.37 pg／ml）蛋白含量明顯比空白對照組IL－1β（8.02± 1.31pg／ml），IL－6（10.30±1.43pg／ml），TNF－α（24.38±4.81pg／ml）及假手術組IL－1β（7.52± 2.11pg／ml），IL－6（11.58±2.56pg／ml），TNF－α（26.12±6.81pg／ml）顯著升高，有統計學意義（P＜0.05）；提示交感神經干炎癥的發生。假手術組與空白對照組相比，無明顯統計學差別（P＞0.05，圖2）。

圖2 ELISA檢測各組大鼠右側L1－5腰交感干細胞因子IL－1β，IL－6，及TNF－α表達。＊示與空白對照組相比有統計學意義（P＜0.05），＃示與假手術組相比有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

雖然腰椎間盤前突出已經被認為是椎間盤突出的類型之一，但是，椎間盤前突導致的癥狀常被臨床忽視。Wong－Chung等［8］報道一例因椎間盤前突而導致腹痛的患者，作者推測椎間盤前突導致的交感神經炎癥反應是該患者腹痛的主要原因。我們在前期［9］進行了一項腰椎間盤前突導致內臟痛的臨床隊列研究，應用單次交感神經阻滯技術評價患者的內臟痛來源于椎間盤前突出導致的交感神經炎癥，對于單次交感神經阻滯有效的患者，給予CT引導下腰交感干置管，連續抗炎治療。結果發現連續抗炎治療對該類患者都取得明顯效果，推測腰椎間盤前突、髓核外漏導致的交感神經炎癥是盤源性內臟痛的主要原因。

炎性細胞因子在機體炎癥反應中的作用已經被廣泛研究，而且，炎性細胞因子的表達已經開始作為椎間盤后突出導致局部炎癥反應的標記性物質。Andrade等［10］報道椎間盤突出患者間盤可分泌IL－1β和IL－6；de Souzaet等［11］報道大鼠椎間盤變性可分泌高濃度的IL－1和TNF－α。Zhang等［7］報道在椎間盤突出患者可在背根結發現有大量TNF－α表達陽性神經元。但是，細胞因子可以從退變椎間盤分泌，同時也可以從椎間盤退變導致局部炎癥反應的炎性細胞分泌。Rand等［12］進一步研究報道體外培養椎間盤退變導致局部浸潤的炎性細胞可分泌比正常細胞高75倍的IL－6，150倍的IL－10，但是IL－1和TNF－α分泌無增加，IL－1和TNF－α可能是在退變椎間盤細胞分泌的。因此，從上述研究來看，IL－1β，IL－6和TNF－α分泌可能來自于不同的細胞，包括椎間盤退變誘導的局部浸潤炎性細胞和退變椎間盤自身細胞，因此，我們選用IL－1β，IL－6和TNF－α這三個細胞因子來檢測，以證實局部炎癥的產生。

我們應用先前研究椎間盤后突出導致脊神經根炎癥的方法，將自體退變髓核注射于交感神經干周圍，交感神經干組織學切片發現有明顯的神經內血管擴張，大量炎性細胞浸潤；并進一步應用ELISA法檢測了交感神經干細胞因子含量，發現IL－1β，IL－6和TNF－α都顯著增高；提示自體退變髓核引起明顯的交感神經干炎癥反應。

本實驗結果證實：髓核前漏出會導致相鄰交感神經的無菌性炎癥的產生。該結論提示椎間盤源性內臟痛可能是由于腰椎前方腰交感神經干自體退變髓核導致的無菌性炎癥累及導致的，同時為腰交感神經抗炎治療盤源性內臟痛提供了理論依據。

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The effects of degenerative autologous nucleus pulposus injected to lumbar sympathetic trunk on expression of inflammatory cytokine in rats

BIAN Jing－jing1，TANG Yuan－zhang2，WU Bai－shan2，et al.（1.Department of anesthesiology，Yuquan Hospital of Tsinghua University，Beijing100049，China；2.Department of Pain Management，Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Beijing100053，China）

ObjectiveThe aim of the study was to observe the inflammatory response of sympathetic trunk by autologous degenerative nucleus pulposus（NP）injection under fluoroscopy.MethodsA total 72rats was used，which divided in 3group：na?ve group，sham group and NP－treated group.24rats in NP－treated group，autologous NP suspension was injected to right sympathetic trunk.14days after injection，right lumbar sympathetic trunk was harvested for histological assessment and ELISA quantitative determination of IL－1β，IL－6，and TNF－αprotein.ResultsIn the NP treated group，endoneural hyperemia and intensive infiltration of inflammatory cells can be seen in section of sympathetic trunk by Hematoxylin and Eosin（HE）stained，Meantime，elevated concentration of IL－1β（20.1±4.40pg／ml），IL－6（26.5 ±8.9pg／ml）and TNF－α（60.77±6.37pg／ml）by ELISA of sympathetic trunk in NP－treated group compared to na?veIL－1β（8.02±1.31pg／ml），IL－6（10.30±1.43pg／ml），TNF－α（24.38±4.81pg／ml）and controlIL－1β（7.52± 2.11pg／ml），IL－6（11.58±2.56pg／ml），TNF－α（26.12±6.81pg／ml）group（P＜0.05）.ConclusionElevated expression of inflammatory cytokine，which caused by degenerative autologous nucleus pulposus injected to lumbar sympathetic trunk，may be related to discogenic visceral pain.

inflammatory cytokine；sympathetic trunk；inflammation；nucleus pulposus；rat

R338.7

A

2014－01－20）

＊通訊作者