酶聯免疫吸附試驗一步法檢測抗—HBc有關問題探討

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是檢測抗-HBc常用方法，根據反應模式可分為一步法和二分法。一步法是將待測樣品和酶標記物同時加入到反應孔中進行反應，從而達到簡便、快速的目的；兩步法是先將樣品加入到反應孔中，待反應結束后再加入酶標記物，從而使待測樣品的“捕獲反應”和酶標記物的“酶聯反應”分開進行，因而反應更加穩定、重復性也更好，但反應時間比一步法長。目前國內用于檢測抗-HBc的試劑盒多為ELISA一步法，在實際工作中，檢測結果有臨床意義，即標本用1：30鹽水稀釋后測定；有流行病學意義，即原血清不做稀釋直接測定，其結果有很大差異，易出現假陰性或假陽性，尤其在臨床上造成很大的困擾，現探討如下；

1 試劑

按說明書保存試劑盒，操作時從冰箱取出，放置于37℃環境恒溫30分鐘，使試劑溫度恢復至37℃后再進行，因一步法反應時間為30分鐘，試劑從冰箱取出恢復到反應溫度需要時間，如果按常規放置至室溫，反應時間達不到要求，抗原抗體反應不完全而可能出現假陰性。

2；離心分離血清：以 3000轉）/分離心3分鐘，然后輕輕剝離纖維蛋白，使纖維蛋白沉淀容易于血清分離，再離心使血清充分分離，否則當血清中混有一定濃度的紅細胞時，由于紅細胞表面有大量的活性物質，容易與反應孔發生非特異性吸附，黏附于孔壁不易被洗脫，加入底物顯色后出現假陽性，血清中的纖維蛋白沒有完全沉淀，血清中過多的纖維蛋白有類同于紅細胞與反應孔相吸附的作用而出現假陽性結果，脂血或乳糜血：脂血或乳糜血可能造成血清黏度加大或屏蔽抗原抗體之間的相互作用，從而降低抗原抗體的結合，使結果出現假陰性，此外，血清中如果含有類風濕因子、自身抗體等非特異性物質，會對ELISA一步法產生干擾，造成假陽性結果，不同時期多次采血有助于減少假陽性。

3.加樣：血清按1：30用生理鹽水稀釋，加樣器要垂直加入，不要傾斜，否則人為加大量，影響結果的準確性，當標本中待測抗體濃度過高時，則抗-HBc-HbP與HbcAg結合少，加入四甲基聯笨胺{TMP}時，顯色淡，標本OD值COV，出現假陰性。因此過量的抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，抗原抗體反應比例不當而不形成夾心復合物，造成抗原或抗體過量即帶現象，，因此血清稀釋可以避免此現象發生。

4 標本溶血

在實際工作中常見引起溶血的原因有：抽血時混入酒精、標本放置不當發生溶血、抽血器質量不合格如真空管負壓不夠或塑料試管質量太差導致溶血、由于病人嚴重脫水、低血容量休克等原因引起穿剌困難造成的溶血、分離血清時用竹簽攪拌不當引起溶血等。溶血是由于各種原因引起紅細胞破壞，細胞內血紅蛋白進入血液，血紅蛋白具有類似于過氧化物酶的活性，其作用與辣根過氧化物酶相似，如果反應孔非特異性吸附血紅蛋白而殘留，可催化底物顯色，造成假陽性。因此要注意采集、保存標本，盡量避免溶血。

5 洗板

洗板不當可引起假陽性或者假陰性。如果洗板的數次太少，殘留在微孔板上的酶標抗體的酶會使后加的無色底物液變成有色產物，產生非特異性反應而出現假陽性。最恰當的洗板數次為5～6次，洗板數次過多、浸泡時間太長、用力沖洗過猛等容易把結合在孔底的抗原抗體復合物洗走而出現假陰性。

6 交叉污染

交叉污染是引起假陽性的原因之一。標本檢測前如果被產生過氧化物酶的細菌（如葡萄球菌）污染，則使結果出現陽性。不同標本之間如果反復使用同一支一次性或未經消毒處理的取樣器材，很容易出現假陽性。因此，為了避免抗HBc實驗室發生交叉污染，臨床實驗室應對直接接觸血液標本的各個實驗環節嚴格使用一次性器材，洗板時用的吸水紙要一次性使用，清洗液要經常更換。

7 藥物干擾

ELISA一步法使用的酶結合物是辣根過氧化物酶，是強氧化劑，極易與強還原劑維生素C發生氧化還原反應，而失去活性。維生素C是臨床上廣泛使用的藥物之一，常在一些危重病人中大劑量使用，使血清中維生素C濃度增高，高劑量的維生素C對ELISA一步法檢測抗HBc產生干擾作用，結果出現假陰性。化驗人員應該了解病人的用藥情況，若給患者使用了高劑量的維生素C，建議用ELISA二步法檢測抗HBc.

8在臨床上，尤其是乙肝五項中前四項陰性，而單純抗-HBc陽性者，必須慎重，因為可見于[1]：既往感染，抗HBs滴度低測不出。[2]低水平病毒攜帶，HbsAg因效價低而檢測不出。[3]核心窗口期，血清中HbsAg和HbeAg消失，抗HBs尚未出現，此時抗HBc可能陽性。[4]被動獲得抗HBc，如經輸血和胎盤獲得，{5}抗HBc假陽性，究竟是假陽性，還是人為因素，還是病理因素，需要消除每個環節影響因素，減輕病人心理負擔減少臨床困擾。可隨防觀察其他抗原抗體的變化，如HbsAg轉為陽性，提示低水平攜帶，而抗-HBs出現陽性提示既往感染，檢測HBV DNA陽性提示低水平攜帶；觀察疫苗接種反應，出現回憶反應者為既往感染，原發反應者為假陽性，無反應著為低水平攜帶。