降脂消斑片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔載脂蛋白A1、載脂蛋白B含量及MMP—9表達(dá)的影響

【摘要】目的 探討降脂消斑片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔載脂蛋白A1、載脂蛋白B含量及MMP-9表達(dá)的影響。方法 運(yùn)用高脂飼料喂養(yǎng)12周以造成日本大耳白兔高脂血癥合并動(dòng)脈粥樣硬化模型，用降脂消斑片灌胃給藥治療4周，采用透射免疫比濁法測(cè)定血清中載脂蛋白A1、載脂蛋白B的含量；采用免疫組化法分析MMP-9在主動(dòng)脈粥樣斑塊中的表達(dá)量。結(jié)果 與模型組比較，降脂消斑片能明顯降低血清中載脂蛋白B的含量，提高載脂蛋白A1含量；差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；同時(shí)也能明顯降低MMP-9在主動(dòng)脈粥樣斑塊中的表達(dá)量，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 降脂消斑片通過(guò)降低載脂蛋白B的水平，提高載脂蛋白A1含量，升高ApoA1/B比值，降低MMP-9在AS斑塊中的表達(dá)，從而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊有穩(wěn)定作用，這可能是其防治動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)理之一。

【關(guān)鍵詞】 降脂消斑片；動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；載脂蛋白A1；載脂蛋白B；MMP-9

【中圖分類(lèi)號(hào)】 R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2014）10-0005-01

基金項(xiàng)目：國(guó)家“十一五”“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2010ZX09101—103）；省教育廳課題（編號(hào)為10C1053）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論重點(diǎn)學(xué)科資助（200706）

降脂消斑片是治療高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的中藥新藥，由虎杖、明礬、大黃、當(dāng)歸等中藥組成，功能化痰清熱、活血通脈，具有良好的臨床療效。為進(jìn)一步探討其療效機(jī)制，本研究采用兔制備動(dòng)物高脂血癥合并動(dòng)脈粥樣硬化模型，觀察降脂消斑片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔載脂蛋白A1、載脂蛋白B含量及MMP-9表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

健康日本大耳白兔40只，雌雄各半，體重（2.1±0.2 ）kg， 3月齡。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證為醫(yī)動(dòng)字第20～003號(hào)。實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第20-001號(hào)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為單籠分裝，室溫22±4℃，相對(duì)濕度60±6%。兔用基礎(chǔ)飼料由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物

降脂消斑片采用不含輔料的干浸膏粉（每克含生藥5.12g），降脂消斑片推薦的每日臨床用量為生藥20.6g/d（長(zhǎng)沙華源醫(yī)藥科技公司提供，批號(hào)：100920），臨用時(shí)蒸餾水溶解配制成含量為0.4mg/ml的藥液。辛伐他汀片20 mg/片，臨床推薦用量為20mg/d（上海信誼萬(wàn)象藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z19980054，批號(hào)090802）。臨用時(shí)蒸餾水溶解配制成含量為0.2mg/ml的藥液。丙基硫氧嘧啶：50mg/片（南通精華制藥有限公司，批號(hào)：110301）。

1.3 試劑

膽固醇粉（分析純，25g/瓶，上海試一化學(xué)制劑限公司，批號(hào)：091025）；豬油；蛋黃粉（陜西天斗蛋業(yè)有限公司提供，批號(hào)：100706142）；載脂蛋白A1 （ApoA1）、載脂蛋白B（ApoB）試劑盒由日本紡織株式會(huì)社公司提供；SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4 主要儀器

LD-A5型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠制造）；722分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；TP-1000電子天平（湘儀天平儀器廠制造）；MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（北京航空航天大學(xué)科學(xué)儀器廠制造）。JEOL-1230型電子顯微鏡（日本JEOL公司制造）；Roche/Hitach7600全自動(dòng)生化檢測(cè)儀（瑞士羅氏公司制造）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

40只日本大耳白兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，稱重，編號(hào)后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將日本大耳白兔隨機(jī)分為正常組（10只），高脂模型組（10只），降脂消斑片劑組（10只），辛伐他汀組（10只）。

2.2 模型制備[1-2]

高脂飼料配方：膽固醇1%.豬油5%，蛋黃粉10%，基礎(chǔ)飼料84%。將加熱溶解后的豬油，與膽固醇、蛋黃粉與基礎(chǔ)飼料一起拌勻，且每100g高脂飼料中加入20mg丙基硫氧嘧啶（約按10mg？kg-1？d-1計(jì)算），并且用飼料制粒機(jī)壓制成顆粒。參照文獻(xiàn)[1-2]，動(dòng)物稱重、編號(hào)后，除留作正常組的動(dòng)物外，同時(shí)以所制備的高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)12周。本次實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)的高脂飼料配方中添加了0.2%丙硫氧嘧啶，以加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，方法為每只動(dòng)物每日上午給予高脂飼料100g，下午給予普通基礎(chǔ)飼料50g。動(dòng)物造模12周后，經(jīng)抽樣檢查，證實(shí)血清血脂明顯升高，剖檢可以見(jiàn)到主動(dòng)脈有明顯的脂質(zhì)粥樣斑塊形成。表明兔高脂血癥合并動(dòng)脈粥樣斑塊模型造模成功。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繼續(xù)喂養(yǎng)4周。

2.3 動(dòng)物給藥

動(dòng)脈粥樣硬化模型造模成功后，根據(jù)成人70kg臨床用藥量按動(dòng)物體表面積計(jì)算給藥量。降脂消斑片組每日灌胃0.39g？kg-1？d-1（相當(dāng)于生藥2g？kg-1？d-1）；辛伐他汀組每日灌胃1.96mg？kg-1？d-1，正常組與高脂模型組動(dòng)物每日灌胃生理鹽水10ml/只/天，每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于每日上午給食前灌胃，灌胃4周。

2.4標(biāo)本采集與制備

2.4.1 血液采集

于實(shí)驗(yàn)第16周末對(duì)家兔禁食12 h（不禁水），次日抽取空腹兔耳中央動(dòng)脈血6mL，分置于常規(guī)非抗凝生化管中，自動(dòng)平衡離心機(jī)3000 r/min離心10min，標(biāo)本離心后取上層血清，分裝于-20℃低溫冰箱保存，待測(cè)：血清ApoA1、ApoB。

2.4.2 標(biāo)本制備

2%戊巴比妥2mL/kg耳緣靜脈注射麻醉，取升主動(dòng)脈至主動(dòng)脈弓約1.5cm，DEPC處理水洗凈，置4%多聚甲醛中固定制備石蠟切片（4μm），用于免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)。

2.5檢測(cè)指標(biāo)

2.5.1 血清載脂蛋白A1（ApoA1）、載脂蛋白B（ApoB）采用透射免疫比濁法測(cè)定。

2.5.2（1）主動(dòng)脈內(nèi)膜中MMP-9表達(dá)含量測(cè)定采用SABC法。（2）結(jié)果判定：MMP-9免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)為棕黃色顆粒，在顯微鏡圖像采集分析系統(tǒng)下，每組選取6張切片，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，精確選取視野內(nèi)主動(dòng)脈粥樣斑塊中的所有陽(yáng)性顆粒，計(jì)算機(jī)自動(dòng)算出面密度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“ X±s”表示，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，再采用單因素方差分析。若有差異進(jìn)行兩組間比較LSD檢驗(yàn)，若方差不齊，采用Tamhane’T2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中部分動(dòng)物因灌胃操作不慎造成死亡，抽樣檢測(cè)2只表明家兔高脂血癥合并動(dòng)脈粥樣斑塊模型形成。最終取得完整資料進(jìn)入實(shí)驗(yàn)分析僅30只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其中降脂消斑片組7只，辛代他汀組8只，模型組7只，正常組8只。

3.2 降脂消斑片對(duì)兔血清載脂蛋白A1、載脂蛋白B及 ApoA1/B的影響：各組血清中ApoA1含量的比較， 模型組血清中ApoA1含量最低，經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)，降脂消斑片組中ApoA1的水平較模型組明顯上升，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.80，P=0.000<0.01）。各組血清中ApoB含量的比較，模型組血清中ApoB的水平最高，經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)，降脂消斑片組中ApoB的水平較模型組明顯下降，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=174.447，P=0.000<0.01）。各組ApoA1/B比較，模型組ApoA1/B最低，經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)，降脂消斑片組中ApoA1/B升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=50.148，P=0.000<0.01）。辛伐他汀組也可升高ApoA1含量，降低血清中ApoB含量，結(jié)果見(jiàn)表一。

4 討論

脂質(zhì)代謝紊亂在促進(jìn)AS形成及其發(fā)展中具有重要作用。ApoAl是高密度脂蛋白中的主要蛋白，具有維持HDL-C結(jié)構(gòu)的作用。ApoB作為L(zhǎng)DL-C的主要蛋白成分，是所有血漿脂蛋白中首要致動(dòng)脈粥樣硬化性脂蛋白。近年來(lái)研究表明，ApoB對(duì)脂類(lèi)的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)起著非常重要的作用，ApoB的升高是最重要的冠心病危險(xiǎn)因素；ApoA1與動(dòng)脈粥樣硬化呈負(fù)相關(guān)，ApoA1/ApoB比值與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[3，4] 。且ApoB、ApoB/ApoA1值與冠脈病變程度關(guān)系密切，反映了動(dòng)脈粥樣硬化的程度[5]。

MMP-9是一種糖蛋白，MMP-9與炎癥反應(yīng)有關(guān)，多種促炎細(xì)胞因子可上調(diào)MMP-9的表達(dá)；同時(shí)MMP-9對(duì)促炎細(xì)胞因子有正反饋?zhàn)饔茫稍鰪?qiáng)其功能[6]。促炎癥因子MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶-9）參與動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)能加速動(dòng)脈粥樣硬化形成的進(jìn)程[7]。MMP-9加劇炎癥反應(yīng)，MMP-9表達(dá)的上調(diào)反映了AS斑塊的活躍程度，表明MMP-9在冠脈表達(dá)增加對(duì)急性冠脈綜合征的發(fā)生有重要意義，較高的MMP-9水平可能提示斑塊易損或破裂[8，9]。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高脂飼料造成日本大耳白兔高脂血癥合并動(dòng)脈粥樣硬化模型。研究結(jié)果顯示，對(duì)模型動(dòng)物運(yùn)用降脂消斑片進(jìn)行干預(yù)后，降脂消斑片可以降低載脂蛋白B的水平，提升載脂蛋白A1含量， 升高ApoA1/B比值；同時(shí)降低MMP-9在主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)量。結(jié)果表明，載脂蛋白A1及載脂蛋白B的異常、MMP-9與AS斑塊的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。MMP-9是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的，雖然與炎癥反應(yīng)有關(guān)，但不是主要的炎癥因子，與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)。故我們認(rèn)為降脂消斑片通過(guò)降低載脂蛋白B的水平，升高載脂蛋白A1含量，升高ApoA1/B比值，抑制MMP-9在主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)，從而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊有穩(wěn)定作用，這可能是其防治動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)理之一

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